3
讨论
虑情绪随之得到改善。本研究观察组治疗后SAS、SDS评分明显低于对照组，妊娠成功率明显高于对照组，与文献报道结果一致
［5］
近年来研究发现不孕症对患者的心理、情感均
［1］
造成一定影响，而行AIH的患者存在不同程度心理问题
［2，3］
。证实CBT心理干预
。研究发现，过度焦虑、紧张可致闭经、
排卵障碍；抑制雌激素、性甾体激素分泌，刺激催乳素分泌；影响卵泡发育及排卵，通过下丘脑—垂体—性腺轴而影响生育。亦可影响AIH妊娠成功率。
CBT强调认知活动在心理或行为问题的发生和治疗过程中既采用各种认知矫转归中的重要作用，
正技术，又采用行为治疗技术，是目前应用最广泛的认为CBT能调节情绪、改善人的心理状态和增进人际交往，使患者内心的抑郁焦虑情绪得到疏泄，对抑郁症、焦虑症的治疗有一
焦虑情绪，是由于定作用。CBT之所以能改善抑郁、
其改变了患者的不良认知，行为表现亦随之发生改
变，从而能用科学的、理性的思维缓解心理冲突，学会并接受新想法，原有的错误认知逐渐改变，抑郁焦心理治疗方法。杨云秀
［4］
可明显减轻不孕症患者抑郁焦虑情绪，提高AIH的
妊娠率；其方法简单易行，值得借鉴。参考文献：
［1］WischmannT，StammerH，SchergH，etal．Psychologicalcharac-teristicsofinfertilecouplesastudybytheHeidelbergFertilityCon-J］．HumReprod，2001，16（8）：1753-1761．sultationService［
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（收稿日期：2012-03-01）
TLR4与TLR9在原发性肝癌组织中的
表达及意义
1234323142
刘晓聪，朱慧芬，杨道锋，曹旭东，邓科兰，黄春梅，胡晓萌，陈琰琰，姜素华，沈关心（1石河子大学医学院生化教研室，石河子832002；2华中科技大学同济医院；
3石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室；4华中科技大学同济医学院）
摘要：目的TLR9在肝癌发生、探讨Toll样受体4（TLR4）、发展中的作用。方法搜集临床经病理证实的肝
肝癌
TLR9表达。结果癌及相应癌旁组织标本、肝血管瘤组织标本，分别用免疫组化法及流式细胞术检测TLR4、
P均＜0．05。结论组织中TLR4表达明显低于癌旁及肝血管瘤组织，而TLR9表达明显高于癌旁及肝血管瘤组织，TLR4、TLR9与肝癌的发生、发展有关；乙肝病毒可能通过拮抗TLR4表达、激活TLR9通路促进肝癌的进展。关键词：肝肿瘤，原发性肝癌；Toll样受体4；Toll样受体9；免疫组织化学法；流式细胞术中图分类号：R735．7
文献标志码：B
266X（2012）23-0070-03文章编号：1002-
据报道，目前，我国主要的慢性肝病是乙型肝炎
［1］
病毒感染所致的慢性病毒性肝炎后肝硬化，可最
likereceptors，终发展成肝癌。Toll样受体（Toll-TLRs）是Ⅰ型跨膜蛋白，能识别侵入体内的微生物
进而激活免疫细胞应答，被认为在先天性免疫系统
TLRs家族中TLR3、TLR4、中起关键作用。据报道，
TLR7、TLR8及TLR9与病毒感染性疾病密切相
［2］
关。本研究通过免疫组织化学及流式细胞术分别检测原发性肝癌癌组织、相应癌旁组织及肝血管
通讯作者：姜素华，沈关心
TLR9的表达，瘤组织中TLR4、旨在探讨二者在肝癌
发生、发展中的作用。1
材料与方法
1．1材料110例临床病理诊断为原发性肝癌患者的癌组织及相应癌旁组织标本，患者男93例，女17例，年龄22～74岁，平均52岁；血清学检测证实患者均有乙肝感染史。同期肝血管瘤患者瘤组织标本10份，患者男5例，女5例，年龄37～55岁，平均44岁；乙肝相关指标均为阴性。主要试剂及仪器有PE-anti-humanTLR4、PE-anti-humanTLR9（eBio-
70
山东医药2012年第52卷第23期
sience公司），小牛血清以及胎牛血清（杭州四季青
Gibco，公司），消化酶（Clostridiumhistolyticum，武汉1640培养液（Gibco公司），FACS天傲生物分装），
Calibur流式细胞仪（BDLSRⅡ，美国），免疫组化TLR4、TLR9一抗（博士德生物工程，武汉/Abcam公司，美国），免疫组化染色试剂盒EnvisionHRP兔\\NU-6613V31型－80鼠通用二抗（上海基因科技），℃低温冰箱，Sigma4K15低温离心机（Sigma，Ger-many）。1．2
TLR4、TLR9水平检测①免疫组化法：采用Elivision二步法进行免疫组化染色，具体步骤参照试剂盒推荐步骤进行，抗TLR4单克降抗体稀释度
DAB为1∶100，抗TLR9单克降抗体稀释度为1∶50，显色，用柠檬酸微波法进行抗原修复，以PBS代替
抗体作为阴性对照组。采用综合评分法，高倍镜下随机计数5个视野，计算阳性细胞所占百分比。阳
11%～性细胞占所有细胞的比例≤10%为0分，25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3
分，≥76%为4分；凡细胞质或细胞核呈浅棕色为1分、棕色为2分、深棕色为3分、不着色为0分。上
1～4分为弱阳性述两积分相乘：0分为阴性（－）、
（+）、5～8分为中等阳性（++）、9～12分为强阳
ProPlus6．0软件进行组化性（+++），并以Image-图像分析。②直接免疫荧光流式细胞术（FCM）：将
获取的新鲜肝癌、癌旁及肝血管瘤组织标本剪成1mm3组织块，用无钙、Hank's液反复冲洗无镁的D-后加入胶原酶进行消化，以用DMEM液终止胶原酶anti-humanTLR4的作用。Facoll管中各自加入PE-PE-anti-humanTLR9抗体20μL和每管抗体5μL、
加入已计数的相应细胞量，混匀，每管设阴性对照，
4mLPBS常温按常规方法室温、避光孵育30min，1200g离心5min/3次洗涤后，再加入0．5～1mL
PBS重悬，FCM上机检测，并用Cellquest软件分析TLR4、TLR9的平均荧光强度及阳性表达率。1．3统计学方法采用SPSS13．0统计软件，计量
珋±s表示，资料以x对计数数据进行t检验和秩和检验，Spearman等级相关检测相关性。检验水准α=
0．05。2
结果
免疫组化法示癌旁组织主要呈现出慢性炎症及
TLR4及TLR9主要为浆/膜表肝硬化的病理表现，
达，而细胞核中无表达（图1）。肝癌、癌旁及肝血管
瘤组织中TLR4表达阳性率分别为0．058434、0．65351、1，P均＜0．05；TLR9表达阳性两两比较，
0．37018、0．07954，P率分别为0．81910、两两比较，
3
图1
肝癌组织、癌旁组织、肝血管瘤组织中TLR4、TLR9表达（IHC×200）
B、C为TLR4表达，D、E、F为TLR9表达注：A、
均＜0．05。FCM检测与免疫组化染色法结果一致，
见图2。肝癌、癌旁及肝血管瘤组织中TLR4表达荧2453、2616，P均＜光强度分别为2168、两两比较，0．05；TLR9表达分别为2280、1907、1428，两两比P均＜0．05。较，
讨论
研究发现，慢性乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝炎和肝硬化是原发性肝癌最主要的因素，TLRs是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，亦是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLRs通过识别病原相关分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs）及某些内源性在天然配体引发信号转导并导致炎症介质的释放，免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统。以往研究认为TLRs主要表达于免疫细胞中，但越来越多的证据表明某些肿瘤细胞亦表达TLRs，TLRs参与调节肿瘤细胞的增殖、存活以及药物敏感性
［3，4］
。
TLR4为TLR的一种，主要识别革兰阴性菌脂
TLR4基因突变或基因多态性多糖。新近研究发现，
与肝癌的发生或恶性程度密切相关
［5］
。肿瘤组织
在侵袭过程中可产生活性氧或应激保护性因子，细
胞坏死崩解释放肿瘤抗原，所有的这些因子可成为TLR4的内源性配体，从而激活TLR信号途径，促进抗原呈递细胞的成熟，进而活化T细胞引起特异性抗肿瘤免疫。TLR4信号途径的激活有助于抗肿瘤
TLR4在慢性肝炎患者的肝免疫的启动。研究发现，
组织中表达上调，而TLR4在肝癌组织中较癌旁组
［6，7］
。本研究发现TLR4在肝癌组织中织表达降低
表达低于癌旁及肝血管瘤组织，与文献报道结果一
致。原因可能为HBV基因编码的病毒蛋白发挥拮乙肝病毒通过拮抗TLR介导的固有免疫应答作用，
抗TLR4表达促进肝癌的发生。
71
山东医药2012年第52卷第23期
TLR9的外源性配体为细菌和病毒研究显示，
DNA中未甲基化的CpG序列，内源性配体为含低甲基化CpG序列的自身DNA，亦是免疫细胞识别病毒和细菌中非甲基化DNA的必需成分。TLR9位于内UNC93B1同样位于内质网内，TLR9质网，激活以后，依赖UNC93B1的方式转移到内体/溶酶体，从而招募适配体蛋白MyD88，通过依赖MyD88的途径激活IRF、AP-l、NF-κB等转录因子，以产生大量的Ⅰ型干从而诱导干扰素的产生扰素和多种炎症细胞因子，
［8～10］
。和一系列免疫应答机制，发挥免疫应答效应TLR9除表达于正常上皮外，研究发现，在肿瘤细胞
中亦有表达，如乳腺癌、中枢系统肿瘤、肺癌、胃癌及
［11～15］
。Tanaka等［16］证实TLR9在85．前列腺癌等
ODN激活TLR97%的肝癌组织中表达，利用CpG-
218-224．
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（收稿日期：2012-04-02）
通路后发现细胞增殖加快，耐药性增加，进一步发现
TLR9激活后凋亡抑制因子（Survivin、Bcl-xL、XIAP等）上调，而TLR9抑制剂处理后诸多相关癌基因下
TLR9在肝癌组织中的表达明调。本研究结果显示，
显高于癌旁组织和肝血管瘤肝组织，提示乙肝病毒
可能充当外源性CpG相似的作用，激活TLR9通路并产生一系列生物学效应，从而促进肝癌的发生、发展。
TLR4、TLR9与肝癌的发生、综上所述，发展有
关，机制可能为乙肝病毒通过拮抗TLR4表达、激活TLR9通路促进肝癌的进展。参考文献：
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72
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