肝细胞癌mage-a9基因的克隆、表达及特性鉴定

南京医科大学倾十学位论文肝细胞癌ＭＡＧＥ—Ａ９基因的克隆、表达及特性鉴定研究生：徐璐导师：冯振卿教授中文摘要肝细胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）在我国发病率高，，临床疗效及预后均很不理想，近来针对肝细胞癌的免疫治疗受到瞩目。但是长期以来，人们未能在肝癌中发现适用于诱导保护性免疫应答的肿瘤抗原，因而阻碍了肝癌免疫治疗的进展。ＭＡＧＥ－Ａ（ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎＡ）基因是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关抗原，这类抗原在正常组织中除睾丸和胎盘外均不表达，但在某些恶性肿瘤高度特异性表达，同时经ＭＨｃ—Ｉ类分子递呈到细胞表面后，可为自体细胞毒一ｔ＆Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）识别，因而是一种ＣＴＬ介导的特异性免疫治疗的理想靶分子。现已知ＭＡＧＥ—Ａ基因家族成员达１２个，各成员间的同源性较高。ＭＡＧＥ—Ａ９ｅＤＮＡ全长９４５ｂｐ，编码分子量约３５Ｋｄ的蛋白产物。迄今未见关于ＭＡＧＥ—Ａ９基因克隆表达及在肝细胞癌中定位的研究报道。本课题在参照国内外相关研究的基础上，设计并完成了以下研究内容：１．从ＨＣＣ组织中抽提总ＲＮＡ，设计引物扩增ＭＡＧＥ—Ａ９基因，经亚克隆、测序鉴定其序列，与ＧｅｎＢａｎｋ数据库比对。２．构建ＭＡＧＥ－Ａ９基因的原核分泌表达系统，分离可溶性表达产物，鉴定并纯化目的蛋白。３．割备抗ＭＡＧＥ－Ａ９抗原的单克隆抗体。４．观察ＭＡＧＥ—Ａ９基因在Ｈｃｃ中的表达及定位。研究方法１．Ｔｒｉｚｏｌ一步法提取肝细胞癌组织总ＲＮＡ，ＲＴ—ＰＣＲ扩增南京医科大学硕士学位论文ＭＡＧＥ—Ａ９基因，经Ｔ—Ａ连接克隆＿＠ｐＭＤｌ８一Ｔ载体，测序，并与ＧｅｎＢａｎｋ数据库登录的ＭＡＧＥ－Ａ９ｃＤＮＡ序列比对。２．限制性酶切图谱鉴定ｐＭＤｌ８一Ｔ—ＭＡＧＥ－Ａ９克隆载体。采用质粒抽提、纯化、酶切、连接、感受态细菌制备和转化等技术，构建并鉴定原核表达载体。药物诱导ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白表达，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ７ｔＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ初步鉴定表达结果，然后将细菌表达产物超声裂解，再用ＨｉＴｒａｐ亲和柱纯化超声裂解上清。３．ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白纯化产物免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。取对数生长期的小鼠骨髓瘤ＳＰ２／Ｏ细胞与免疫小鼠的脾细胞按常规ＰＥＧ方法融合，有限稀释法克隆细胞。ＥＬＩＳＡ＇法检测杂交瘤培养上清与ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白的效价，Ｄｏｔｂｌｏｔ检验细胞培养上清与ＭＡＧＥ—Ａ９的结合活性。４．免疫组４ｔＡＢＣ法检坝ＪＭＡＧＥ－Ａ９基因在Ｈｃｃ组织中的表达及细胞定位。研究结果１．扩增出约９４５ｂｐ的ＭＡＧＥ—Ａ９基因，测序证实其序列与ＧｅｎＢａｎｋ数据库报道序列完全一致。２．限制酶切结果显示克隆载体ｐＭＤｌ８－Ｔ—ＭＡＧＥ－Ａ９构建成功。原核分泌型表达系统ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ州ＡＧＥ—Ａ９在大肠杆菌Ｔｏｐｌ０中被诱导表达，获得有多聚组氨酸（Ｈｉｓ）。标签序列的重组表达蛋白，冷冻超声裂菌法分离结果显示ＭＡＧＥ—Ａ９表达蛋白在菌体大部分为可溶性表达。用ＨｉＴｒａｐ柱纯化细菌表达产物，获得ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白纯化产物。３．ＥＬＩｓＡ法检测杂交瘤培养上清，经３次亚克隆，阳性率达１００％，获得稳定分泌特异性抗ＭＡＧＥ—Ａ９单抗的杂交瘤细胞株，命名为ＡＭ９。ＤｏｔｂｌｏＵ去检测杂交瘤细胞培养上清可与ＭＡＧＥ—Ａ９特异南京医科人学硕Ｌ学位论文性结合。《．免疫纽化结果蜊ＡＧＥ－Ａ９在疆ｃｃ中主要定位于癌细胞胞结论本文通过构建肝细胞癌ＭＡＧＥ－Ａ９基因的克隆载体ｐＭ３］８－Ｔ—浆，３９例ＨＣＣ，阳性表达８例，阴性３１例，阳性表达率为２１％。ＭＡＧＥ－Ａ９勇Ｌ原核表达系统ｐＢｈＤ绳Ｈ卜ＭＡＧＥ－Ａ９。潮备了抗ＭＡＧＥ－Ａ９单克隆抗体，首次证实ＭＡＧＥ—ｔｉ９－｛，ｔ原在ＨＣＣ中主要为胞浆表达，提示ＭＡＧＥ—Ａ９可能成为ｌｉｃｅ特异性免疫治疗的潜在靶点，也为进一步研究肝癌发生的分子机制奠定了基础。【关键词】ＭＡＧＥ－Ａ９；ＲＴ－ＰＣＲ；基因克隆；基因表达；单克隆抗体；免疫组化——Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ堕塞垦型查兰塑：！兰堡堡兰ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｏｆＨｕｍａｎＭｅｌａｎｏｍａＣａｒｃｉｎｏｍａｓＡｎｔｉｇｅｎＭＡＧＥ－Ａ９ＨｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＡＢＳＴＲＡＣＴＴｈｅａｎｙｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆＨＣＣｉｓｈｉｇｈｉｎＣｈｉｎａ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅｈａｓａｇａｉｎｓｔｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｎｏｓａｔｉｓｆｉｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｄｅｖｅｌｏｐｖａｃｃｉｎｅｓｃａｎｃｅｒ－ｉｓＨＣＣｆｏｒｕｓｅｆｕｌｔｒｅａｔｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｙｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙａｇａｉｎｓｔａｎｔｉｇｅｎｓｔｈａｔａｒｅｃｏｍｍｏｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎｔｈｉｓｔｙｐｅｏｆＩｔｈａｓｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅＭＡＧＥ—ＡｈａｓｉｎＨＣＣｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｕｍｏｒ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｉｇｈ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｇｅｎｅｓｍａｄｅｔｈｅＭＡＧＥ—Ａｇｅｎｅｓｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇａｓｃａｎｄｉｄａｔｅｓｆｏｒａｎｔｉｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ１９９１，ｖａｌｌｄｅｒＢｍｇｇｅｎｅｔａ１．ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｅｆｉｒｓｔｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ１２ｇｅｎｅ，ＭＡＧＥ—ＡＩ，ｉｎａｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ．Ｓｉｎｃｅｔｈｅｎ，ＭＡＧＥ．Ａｇｅｎｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙ．ＧｅｎｅｓｏｆＭＡＧＥ—Ａｆａｍｉｌｙａｒｅａｒｅｏｆｓｏｌｉｄｓｅｖｅｒａｌｉｎｔｙｐｅｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｔｕｍｏｒｓｂｕｔｓｉｌｅｎｔｉｎｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓｗｉｔｈｔ１１ｅｅｘｃｅｐｔｉｏｎｏｆｍａｌｅａｒｅｇｅｒｍｌｉｎｅＭＡＧＥ＿Ａｅｎｃｏｄｅｄｇｅｎｅｓｂｙｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｐｅｐｔｉｄｅｓｃａｌｌｔｈａｔａｎｔｉｇｅｎｓｓｔｒｉｃｔｌｙｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｂｅｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＣＴＬａｎｄｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｐｒｏｍｉｓｉｎｇｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｒａｐｙ．ＭＡＧＥ＿Ａ９ｉｓｏｆＤａｒ七ｉｃｕｌａｒｒｅｌｅｖａｎｃｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｅｘｔｏｆｔｈｅＭＡＧＥ—Ａｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ，ｈａｓｉｔｓｔｏｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐｒｏｄｕｃｔｈａｓｂｅｅｎＸ，ａｎｄｇｅｎｅｗｈｉｃｈｍａｐｐｅｄｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｐｒｏｔｅｉｎｏｆａｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｐｐａｒｅｎｔＭｒｏｆｔｈｅａｂｏｕｔｉｓｋｎｏｗｎｌｉｔｔｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ３５，０００．ＳｉｎｃｅＭＡＧＥ－Ａ９ｉｎｔｈｅｅｘａｍｉｎｅｄｉｎＣｈｉｎｅｓｅｃａｒｃｉｎｏｍａｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，ｗｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＧＥ—Ａ９ｉｎ３９ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅ‘８ｏＩｆｕｌｆｉｌｌｅｄｓｏｍｅｔｈｉｓｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｓｔｕｄｙ，ｗｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｏｂｊｅｃｔｓ·ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ：４——一ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅ，ｔｏ堕室垦！！查兰堡！：兰垡堡塞１·ＴｏｅｘｔｒａｃｔｔｏｔａｌＲＮＡｏｆＭＡＧＥ—Ａ９ｇｅｎｅｆｒｏｍｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｌａｒａｍｐｌｉｆｙｔｈｅＭＡＧＥ—Ａ９ｃＤＮＡｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｔｏｓｕｂｃｌｏｎｅｉｔｉｎｔｏｔｈｅＴ－ｖｅｃｔｏｒｆｏｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅ．２．ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＭＡＧＥ—Ａ９ｇｅｎｅ，ｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙａｎｄｐｕｒｌ匆ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｄｕｃｔｓ．３．ＴＯｇｅｎｅｒａｔｅｔｈｅ４．ＴＯＨＣＣｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｏｆＭＡＧＥ—Ａ９ａｎｔｉｇｅｎｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＩｏｃａｔｉｏｎｏｆＭＡＧＥ。Ａ９ｉｎＭｅｔｈｏｄｓ１．ＴｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｂｙｕｓｉｎｇＴｒｉｚａｏｌａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ．ＭＡＧＥ．Ａ９ａｃＤＮＡｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ｌｉｇａｔｅｄｗｉｔｈｓｉｍｉｌａｒｌｙｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｐＭＤ．１８Ｔａｆｔｅｒｃｏｍｐａｒｉｎｇｗｉｔｈｓｉｍｐｌｅｖｅｃｔｏｒ，ｓｅｑｕｃｅｃｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄＧｅｎＢａｎｋ．２．ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｌａｓｍｉｄｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｍＥｃｏＲｌａｎｄＨｉｎｄＩＩＩａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｖｅｃｔｏｒｐＢＡＤ／ｇｌｌｌｗｉｔｈｓｉｘ－ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｔａｇａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＴＯＰｌ０．ＴｈｉｓＣｕｌｔｕｒｅｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬ—ａｒａｂｉｎｏｓｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＨｉＴｒａｐａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎｓ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｍｏｎｉｔｏｒｅｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｈａａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ．３．ＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅｄｍａｔｅｒｉａｌ．ａｓＡｎｉｍａｌｓｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ，ａｎｄｆｕｓｉｏｎｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｍｌｅｄｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ．ＨｙｂｒｉｄｏｍａｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙＥＬＩＳＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｕｓｅｄａｓＭＡＧＥ—Ａ９ｔｈｅａｎｔｉｇｅｎ．ＴｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＳＤＳ—ＰＡＧＥａｎｄＤｏｔｂｌｏｔ．４．ＴｈｅｗｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＭＡＧＥ—Ａ９ｉｎＨＣＣｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｓｓａｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＳ南京医科火学硕十学位论义１．Ｔｈｅ９４５ｂｐｐｒｏｄｕｃｔｗａｓＳａＢｌｅＭＡＧＥ—Ａ９ｔｏｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｉｔｓｓｅｑｕｅｎｃｅｏｎＭＡＧＥ—Ａ９ｃＤＮＡｐｕｂｌｉｓｈｅｄＧｅｎＢａｎｋ２．ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｐＭＤ１８一Ｔ——ＭＡＧＥ—Ａ９ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎｏｆｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｌ—ａｒａｂｉｎｏｓｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｐｒｏｔｅｉｎｐＢＡＤ／ｇｌＩＩ·－ＭＡＧＥ·－Ａ９ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇａｎａｐｐａｒｅｎｔｒｅｓｕｌｔｅｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａＭｒ３５，０００，ｍａｔｃｈｉｎｇｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｄｅｓｃｒｉｂｅｄＭＡＧＥ—Ａ９ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＰｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇＨｉＴｒａｐｃｏｌｕｍｎ．３．ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆＥＬＩＳＡｗａｓ１００％ａｆｔｅｒｔｈｒｅｅｓｕｂｃｌｏｎｅｓｓｅｃｒｅｔａｎｄａｓｔａｂｌｅｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｔｈａｔｃａｎｓａｎｔｉ－－ＭＡＧＥ－—Ａ９ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｈａｓｂｅｅｎｃｒｅａｔｅｄａｎｄｔｈｅｎｂｅｅｎｎａｍｅｄＡＭ９．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤｏｔｂｌｏｔｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓｅｃｒｅｔｉｎｇ０ｎａｎｔｉ－－ＭＡＧＥ—－Ａ９ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｗｅｄｅｘｃｌｕｓｉｖｅｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｈｅＭ＿ＡＧＥ—Ａ９ｐｒｏｔｅｉｎ．４．ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭＡＧＥ－Ａ９ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔａｗａｓａｔｔｅｍｐｔｅｄｉｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ—ＭＡＧＥ—Ａ９ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｉｓｓｕｅｓｏｆ３９ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｆｏｒＭＡＧＥ—Ａ９ｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａｍｏｎｇｃａｒｃｉｎｏｍａｓ３９ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＭＡＧＥ—Ａ９ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ８ｃａｓｅｓｆ２１％）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＭＡＧＥ－Ａ９ａｎｔｉｇｅｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｆｌａｉｒｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，ｔｈｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓｍｉｇｈｔｂｅｓｕｉｔａｂｌｅｃａｎｄｉｄａｔｅｓｆｏｒｉｍｍｕｎｅｉｎｖｏｌｖｉｎｇａｎｔｉｇｅｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙｇｅｎｅ－ＭＡＧＥ—Ａ９【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ１ＭＡＧＥ—Ａ９；ＲＴ—ＰＣＲ；ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｔｒｙ６南京医科人学硕十学位论文前言恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病。２０００年，我国恶性肿瘤发病２００万，死亡１５０万，在城市居民死因顺位中居第一位，在农村居民死因顺位中居第二位。肝细胞癌（ＨＣＣ）是恶性肿瘤中危害性最大的疾病之一，其发病率很高，尤其集中于发展中国家，中国的ＨＣＣ发病数占全球发病总数的４３％，而且近年来其发病率与死亡率均呈上升趋势…。然而由于Ｈｃｃ多发于中老年人，起病隐匿，且多合并肝硬化等并发症，所以一直以来ＨＣＣ的临床疗效及预后均很不理想，手术切除率及术后生存率均较低，一年术后生存率仅为３９。７％。在过去２０多年中，研究人员发明了多种癌症免疫治疗方法，如：细胞因子及其它生物调节因子、ＬＡＫ细胞、ＴＩＬ细胞、放射线灭活肿瘤细胞等。然而几乎所有的这些治疗措施都未能激发持久的免疫反应，包括肾细胞癌和黑色素瘤（这两种肿瘤对免疫治疗相对更敏感）。而肿瘤特异抗原的发现和确定，以及随后的肿瘤与宿主相互作用的分子机制的阐明，为研发新的肿瘤疫苗提供了可能。因而近年来针对肿瘤的免疫治疗成为研究热点而肿瘤免疫治疗的关键问题在于能否找到更多特异的肿瘤抗原。自＆ｋｌ９９１年ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ等首次成功地分离出了人黑色素瘤ＭＡＧＥ（ｍｅｌ８ｎＯｍｇａｎｔｉｇｅｎ）抗原，并建立了克隆肿瘤抗原的技术路线，ＭＡＧＥ基因就成为了肿瘤免疫治疗的研究热点…。ＭＡＧＥ—Ａ为ＭＡＧＥ家族中的一个亚家族，这类抗原在正常组织中除睾九和胎盘组织外均不表达，但在某些恶性肿瘤高度特异性表达，经ＭＨｃ—Ｉ类分子递呈到细胞表面后，可为自体细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）识别¨１，因而ＭＡＧＥ—Ａ基因南京医科人学硕上学位论文可成为一种ＣＴＬ介导的特异性免疫治疗的理想靶分子。另有报道ＭＡＧＥ－Ａ基因不但能激发细胞免疫，也能诱导体液免疫…，因而ＭＡＧＥ—Ａ在肿瘤免疫治疗中得到比较广泛的应用｜５１。相关的免疫治疗实践主要集中在如下方面：周ＭＡＧＥ—Ａ抗原肽疫苗诱导扩增特异性ＣＴＬ进行过继免疫治疗¨１；用人工合成的ＭＡＧＥ—ｈ抗原肽脉冲处理树突状细胞（ＤＣ）或用ＭＡＧＥ—Ａ基因修饰的Ｄｃ制成Ｄｃ疫苗，对肿瘤患者进行免疫治疗¨－”。迄今已知ＭＡＧＥ－Ａ基因家族成员达１２个，均定位于Ｘｑ２８㈨１，特异性表达于多种恶性肿瘤及正常睾丸和胎盘。ＭＡＧＥ—Ａ家族各成员问的同源性较高，ＭＡＧＥ－Ａ９是ＭＡＧＥ—Ａ家族中的一员，ｅＤＮＡ全长９４５ｂｐ，编码分子量约３５ｋＤ的蛋白产物。虽然ＭＡＧＥ—ｈ家族由于它们在肿瘤中的广泛表达及诱导肿瘤免疫反应的能力，而成为肿瘤免疫治疗的热点，但有关ＭＡＧＥ—Ａ９的研究，无论是国内还是国外都少之又少。而且由于缺乏特异性单克隆抗体，仅有的少量关于ＭＡＧＥ～Ａ９基因的研究也都停留在基因水平，如ＭＡＧＥ—Ａ９在食管腺癌相关醚ｊ１３ａｒｒｅｔｔ食道中过表达”１，在皮肤Ｔ细胞淋巴瘤阳性表达¨州等。但是基因与蛋白水平的表达并不完全一致，更重要的是，肿瘤免疫治疗是以抗原的确切定位为基础的，有关ＭＡＧＥ—Ａ９基因的克隆、表达、单抗制备，以及在Ｈｃｃ中表达的研究迄今未见报道。本文首次通过克隆、表达肝细胞癌ＭＡＧＥ—Ａ９基因，制备抗ＭＡＧＥ—Ａ９的单克隆抗体，观察ＭＡＧＥ—Ａ９基因在Ｈｃｃ中的表达及定位，为ＨＣＣ的免疫治疗及阐明其发生发展的分子机制奠定基础。南京医利大学母ｉ上学｛｝７＿论义材料和方法１．ＨＣＣ女］Ｉ织ＯｆｒＭＡＧＥ－Ａ９基因的克隆、表述１．１主要材料１．１．１临床标本：ｌｉｃｅ手术切除新鲜标本１例，取自江苏省肿瘤医院住院病人（男性，５０岁，病理诊断证实为ＨＣＣ），液氮保存。１．１．２菌株和质粒：大肠杆菌菌株ＴＧｌ（ｓｕｐＥｈｓｄＡ５Ｌｈｉ△（１ａｃ—ｐｒｏＡＢ）Ｆ７［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ‘ｌａＣＩ。ｌａｃＺＡＭｌ５］）及Ｔｏｐｌ０Ｆ，ｍｃｒＡ，么△（ｍｒｒ—ｈｓｄＲＭＳ—ｍｃｒＢＣ），由８０１ａｃＺ』Ｍ１５，彳△ｌａｃＸ７４，ｄｅｏＲ，ｆｅｃＡｌ，ａｒａＤｌ３９，Ａ△（ａｒａ—ｌｅｕ）７６０７，ｇａｌＵ，ｇａｌＫ，ｒｐｓｌ，ｅｎｄＡｌ，ｍｕｐＧ由本实验室保存。质粒ｐＭＤｌ８－Ｔ购自大连宝生物公司，ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ载体购自Ｉｎｖｉ１．１．３主要试剂：ｔｒｏｇｅｎ／涧。（ｉ）ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ购自华美公司；羊抗鼠抗ＨｉＳ抗体购自Ｍｅｒｃｋ公司；②ＴｒｉＺＯｌ试剂及ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒购自ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司：③ＰｅＲ试剂，ＥｘＴａｑ酶，ＤＬ２限制性内切酶ＦｃｏＲ０００、ＤＬｌ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，Ｉ、［１ｉｎｄＩＩＩ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶，质粒小量提取及小量胶回收纯化试剂盒等购自大连宝生物公司；④丙烯酰胺，亚甲双丙烯酰胺，ＡＰ，ＴＥＭＥＤ，左旋阿拉伯糖（Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｓｅ）购自Ｓｉｇｍａ公司；⑤ＤＥＰＣ、溶菌酶、硝酸纤维紊膜等购自上海生工生物工程公司；⑥低分子量标准蛋白质Ｍａｒｋｅｒ，预染低分子量标准蛋白质Ｍａｒｋｅｒ购自Ｂｉｏ～ＲＡＤ公司，苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）购自上海丽珠９南京医利人学硕士学位论文东风生物技术公司；⑦Ｈｉｔｒａｐ镍亲合柱购自Ａｍｅｒｓｈａｍ公司：⑧其它常用试剂均为国产分析纯１．１．４主要仪器①Ｈ１９８１２７放水型袖珍ｐＨ／温度电脑测试笔ＨＡＮＮＡ②Ｄ一３７５２０Ｏｓｔｅｒｏｄｅ低温高速离心机ＨＥＲＡＥＵＳ③ＴＰｅｒｓｏｎａｌＰＣＲ仪Ｂｉｏｍｅｔｒａ④Ｄ０１ｐｈｉｎ－Ｄｏｃ凝胶成像系统⑤ＥＰＳ６０４稳压稳流电泳仪⑥ｚＦ型紫外透射反射分析仪Ｗｅａｌｔｅｃ南京新校园研究所上海嘉鹏有限公司Ｂｉｏ—ＲＡＤＯＡＧＩＫＥＷＯＲＫＳ⑦蛋白电泳仪（ＰＯＷＥＲ／ＰＡＣ２００），电转移仪⑧超声破碎仪⑨ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ酶标仪Ｔｈｅｒｍｏ⑩恒温水浴箱ＰＯＬＹ—ＳＣＩＥＮＣＥ１．２ＨＣＣ组织总ＲＮＡ提取、鉴定及ＲＴ—ＰＣＲＨＣＣ总ＲＮＡ提取及鉴定１．２．１将一小块约ｌｃｍ３ＨＣＣ组织从液氮中取出，置于经ＤＥＰＣ和灭菌处理的玻璃匀浆器中，加入ｌｍｌＴｒｉｚｏｌ，反复研磨直到看不见固体物质后，将匀浆转入１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，加入０．２ｍｌ氯仿振荡混匀，静置１５ｍｉｎ，４℃离心（１２０００ｒｐｍｘ１０ｍｉｎ），吸取上层液相。转移至一新的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，加入０．５ｍｌ异丙醇，室温沉淀１０ｍｉｎ，４℃离心（１２０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ），弃上清，沉淀用７０％冰乙醇洗涤，空气干燥，重溶于适量的０．１％ＤＥＰＣ水中，置一７０℃保存备用。总ＲＮＡ的鉴定：南京医科大学坝上学佗论文①紫外分光光度仪检测：测定ｏＤ：。。与０Ｄ：。值，要求ＯＤ：。／０Ｄ：。。在１．８～２．０，并根据ｏＤ。值和稀释倍数计算总ＲＮＡ浓度，稀释至《１“ｇ／“１。②甲醛变性胶电泳鉴定ＲＮＡ质量配制１％甲醛变性胶：称取２４０ｆⅡｇ琼脂糖，溶于ｉ２．４３ｍｌＤＥＰＣ水，冷却到６０℃后加入４ｍｌＭＯＰＳ，４０ｍＭ乙酸钠，５ｍＭＥＤＴＡ５ｘＯ．１｛５ＭＯＰＳ缓冲液（０．１ＭｐＨ７．０Ｈ１ｐＨ８．０）、３．５７ｍｉ甲醛和２ＥＢ（１０ｍｇ／ｍ１），混匀后灌胶。配上样的ＲＮＡ样品：取ＲＮＡ样品５．５“１与５×ＭＯＰＳ缓冲液５．０“１，甲醛４．５“ｌ，甲酰胺１ｏ“１混匀后，于６５℃温育１５ｍｉｎ，冰浴冷却，离心收集于管底。加５“１甲醛加样缓冲液（５ｏ％甘油，ｌｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０，０．２５％溴酚蓝，０．２５％二甲苯青ＦＦ），于５０Ｖ电泳２ｈ。紫外灯下观察，２８Ｓ：１８Ｓ在２：１左右者为符合要求的总ＲＮＡ样品。１．２．２ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＭＡＧＥ—Ａ９基因①ｃＤＮＡ第一链合成：以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物进行反转录，取５×Ｂｕｆｆｅｒ８“ｉ，２．５ｍＭｄＮＴＰｓ１２“ｌ，ｌｕｇ／ｕｌＯｌｉｇｏ（ｄＴ）ｌ８２“ｌ，总ＲＮＡ体积４０８ｕｌ，ＲＮＡｉｕ１＂ｌ，ＲＴａＳｅｌ¨ｌ，ＤＥＰＣＨ２０８．ｕ１，反应总ｌ，４２℃１ｈ逆转录反应，６５℃３０ｍｉｎ终止反应并灭活ＲＴａｓｅ。置一２０℃保存备用。②寡聚脱氧核苷酸引物的设计：根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＭＡＧＥ—Ａ９基因序列设计引物ＰＩ：５’ＣＡＣ丛昼堡！！ｃＧＧＡＣＴＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＰ２：５’ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴ３’；３’，分另４；ｌ入ｔｔｉｎｄＩＩＩ和ＥｅｏＲＩ酶切位点，由北京赛百盛公司合成。③ＰＣＲ反应：堕墨！至羔！△堂堡±堂些丝兰以ｅＤＮＡ为模板，ＰＣＲ反应体系：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ（Ｍｇ“Ｆｒｅｅ）５“１５ｕＭｇＣｌ２（２５ｍｉｖｌ）ｌｌｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）５ｕ上游引物（２ｏｐＭ／“１）下游引物（２０ｐＭ／Ｈ１）ＴｅｍｐｌａｔｅＥｘ２¨１２ｕｌ２Ｕ１Ｏ．５ｕ１Ｔａｑ（５ｕ／¨１）ｄｄＨｔ０２８．５５０ｕｌ总体积ｕ１采用以下反应条件：９４℃４ｍｉｎ预变性，９４℃５０ｓ变性，５８℃５０ｓ退火，７２℃６０ｓ延伸，共３０个循环，７２℃终末延伸７ｍｉｎ。④ＰＣＲ产物的鉴定和纯化５０ＥＤＴＡ２ｘＴＡＥ贮存液配制：Ｔｒｉｓ６０．５９，冰醋酸１４．３ｍｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ５ｍｌ，加ｄｄＨ：０至２５０ｍｌ。１．Ｏ％琼脂糖凝胶配制：琼脂糖１．Ｏｇ，１×ＴＡＥ溶液１００ｍｌ，加热至琼脂糖融解，冷却至５０℃左右时加入溴乙锭至０．５“ｇ／ｍｌ，铺板凝固后使用。琼脂糖凝胶电泳：电泳槽中注入１×ＴＡＥ溶液至高于凝胶面，取１０“１ＰＣＲ产物，加１样，用ＤＬ２０００ＤＮｈｐｌ的１０ｘＤＮＡ上样缓冲液，混匀上Ｍａｒｋｅｒ作为参照，８０Ｖ电泳。ＰＣＲ产物的纯化（参照试剂盒操作手册）：紫外灯下，用切胶器切下含目的基因ＤＮＡ条带的琼脂糖块，放入１。５ｍｌ离心管中，称重，计算胶块重量；每１００ｍｇ胶块加入３００ｕ１的溶胶液，置２南京医科夫学硕Ｌ学位论文５０℃水浴１０ｍｉＦＩ，使琼脂糖胶完全溶化，期间颠倒混匀数次；将溶化的液体移入吸附柱，离心弃收集液，用洗涤液洗两次；离一，１２后将吸附柱置一干净的ｔ．５ｍｌ离心管中，在吸附膜中央加入３０“１洗脱液，静置ｌｍｉｎ后１２０００ｒｐｍ离·，１２ｌｍｉｎ，离心管中的液体即为回收的ＤＮＡ，一２０。Ｃ保存备用。１．２．３ｐＭＤｌ８－Ｔ－ＭＡＧＥ—Ａ９克隆载体的构建①将纯化的ＰＣＲ产物与ｐＭＤｌ８一Ｔ载体进行Ｔ—Ａ克隆重组。连接反应体系：目的基因片段（ＭＡＧＥ—Ａ９）４．５“ｌｐＭＤｌ８－ＴｖｅｃｔｏｒＬｉｇａｔｉＯｉｌＳｏｌＵｔｉＯｉｌＩＯ．５ｕｌ５“ｌ连接反应条件：１６℃连接４ｈ。②重组体的细胞转化ＬＢ液体培养基配制：Ｂａｃｔｏ—ＴｒｙｐｔｏｎｅＥｘｔｒａｃｔ５９，ＮａＣｌ１１０９，Ｂａｃｔｏ—Ｙｅａｓｔ０９；加ｄｄＨ２０溶解，用１０ＮＮａＯＨ调ｐＨ值至７．４，定容至１０００ｍｌ，１５磅高压灭菌２Ｏｍｉｎ，４℃保存。ＬＢ固体培养基配制：取ＬＢ液体培养基１ＯＯｍｌ，加１．５９细菌培养用琼脂粉，１５磅高压灭菌２０ｍｉｎ，无菌状态下铺制平板，４℃保存备用；如需配制选择性平板，则待其冷却至５０℃左右时加入抗生素或其它添加成分，混匀后铺平板备用。０．１ＭＣａＣＩ２溶液配制：ＣａＣｌ２·２Ｈ２０２．９４９，溶于２００ｍｌｄｄｌｔ：０中，０．２２“ｍ滤器过滤除菌，一２０℃贮存。感受态细胞制备：用接种环沾取少许一７ｏ℃冻存的昱ｃｏｌｉＴＧｌ，划线接种于ＬＢ平板上，３７℃培养过夜。次日挑取单菌落接南京医科大学硕上学位论文种入３ｍｌＬＢ液体培养基中，３７℃振荡培养过夜。然后以１：５０接种入３ｍｌＬＢ液体培养基中，３７℃剧烈振荡（２５０ｒｐｍ）培养约２～３ｈ（ＯＤｓ。约为０．３～０．４）后取出，立即置冰浴１０ｍｉｎ，分成２管，４℃，４０００９离心１０ｍｉｎ，弃上清，每管加冰顸冷的０．１ＭＣａＣｌ：ｍｉｎ，溶液ｌｍｌ，轻轻重悬菌体，置冰浴３０ｎｆｉｎ；４℃，４０００９离心１０弃上清，倒置于无菌滤纸上ｌｍｉｎ，再以１００溶液轻轻重悬菌体，置４℃，用于转化。ｕ１冰预冷０．１ＭＣａＣｌ：Ａｍｐ溶液配制：氨苄青霉素钠溶于ｄｄＨ，０，配成５０ｍｇ／ｍｌ，过滤除菌，分装－２０６Ｃ贮存，工作浓度５ｏ“ｇ／ｍｌ。取上述／７．ｃｏｌ／ＴＧｌ感受态细胞１００“１，无菌条件下加入亚克隆重组体１０“ｌ，轻旋混合，冰浴３０ｍｉｎ，静置４２℃水浴热休克９０ｓｅｃ，再冰浴５ｍｉｎ；加入无抗生素的ＬＢ液体培养基４ｏＯ“１，３７℃，１５０ｒｐｍ振荡培养１ｈ使细胞复苏；再以９０００ｒｐｍ离心５０ｓｅｃ，弃去４００“１上清，重悬余下的茵体；取ＬＢＡｍｐ‘选择性平板，用１００ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ１００“ｌ和４０ｍｇ／ｍｌＸ－ｇａｌ２０肚ｌ混合液均匀涂布平板，置３７℃培养箱吸收２０ｍｉＦｉ，用无菌接种棒将上述菌液均匀涂布该平板，正放吸收２０ｍｉｎ，再倒置，３７℃培养过夜。③阳性重组体的筛选鉴定观察上述过夜培养的选择性平板，其菌落颜色可供初步筛选，含重组子的阳性菌落呈白色，不含重组子的阴性菌落呈蓝色。挑取白色单菌落，接种于ｌｍｌＡｍｐ‘的ＬＢ液体培养基中，３７℃２００ｒｐｍ振荡６～８ｈ后取菌液做ＰｅＲ鉴定，以初步筛选的菌液为模板，反应体系及条件同１．３．２，１．Ｏ％琼脂糖凝胶电泳检测。经蓝／白斑筛选与菌液ＰＣＲ鉴定重组子含目的ＤＮＡ后，对重组体１４南京医科大学硕士学位论文ＤＮＡ进行序列测定，测序引物为Ｍ１３—４７和ＲＶ—Ｍ，采用ＡＢＩ３７７ＸＬＰＲＩＳＭ“ＤＮＡ测序仪，由大连宝生物工程有限公司提供测序报告。登陆ＮＣＢＩ网站与ＧｅｎＢａｎｋ登录序列（见附录）进行比对。１．２．４ＭＡＧＥ－Ａ９基因与原核分泌型表达载体ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ重组①提取ｐＭＤｌ８－Ｔ－ＭＡＧＥ—Ａ９重组质粒和载体ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ质粒：取已鉴定含有质粒的单一克隆菌，接种到Ａｍｐ。的ＬＢ液体培养基中，３７℃振荡培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒提取质粒ｐＭＤｌ８－Ｔ—ＭＡＧＥ－Ａ９。同样方法获得表达载体ｐＢＡ３／ｇＩＩＩ。②目的基因片段的双酶切和回收双酶切反应体系：ｐＭＤｌ８－Ｔ－ＭＡＧＥ—Ａ９１０×Ｈ４０“ｌ５１．５１．５ｕｂｕｆｆｅｒ１１１ＥｃｏＲＩＨｉｎｄＩＩＩｄｄＨ２０ｕｕ２“１５０“１ｈ总体积双酶切反应条件：３７℃４～６双酶切反应产物检测：１％琼脂糖凝胶电泳紫外灯下切胶回收纯化ＭＡＧＥ－Ａ９基因片段，方法同前。③含有粘性末端的线性ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ载体的制备双酶切反应体系：ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ质粒ＤＮＡ１０×ＨｂｕｆｆｅｒＦｃｏＲＩ１６批１２“１１Ｕｌ１“１ＨｉｎｄｌＩＩ南京医科大学硕十学位论文总体积２０ｕ１双酶切反应条件：３７℃４～６ｈ双酶切反应产物检测：１％琼脂糖凝胶电泳紫外灯下切胶回收纯化线性ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ栽体，方法同前。④目的基因与载体ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ的定向连接用ＤＮＡ定量Ｍａｒｋｅｒ在凝胶成像系统中分析纯化的ＭＡＧＥ－Ａ９和ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ的ＤＮＡ量，设计连接反应体系。连接反应体系：ＭＡＧＥ—Ａ９６“１Ｉ２．５１ｕｐＢＡＤ／ｇＩＩ１１１１０×Ｔ４ＤＮＡＬ［ｇａｓｅｂｕｆｆｅｒＴ４ｕＤＮＡＬｉｇａｓｅ０．５ｕ总体积１Ｏｕ１１连接反应条件：６℃连接过夜⑤重组体阳性菌落鉴定：制备￡ｃｏｔｉＴＧＩ的感受态细胞，取１０“ｌ连接产物进行转化，将菌液均匀涂布Ａｍｐ‘的ＬＢ平板，３７℃倒置培养过夜。从平板上挑取最ｃｏｉｌＴＧｌ单菌落接种于Ａｍｐ‘的ＬＢ液体培养基，３７℃振荡培养扩增，提取质粒ＭＡＧＥ－Ａ９－ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎａｑＩＩ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。１．２．５重组蛋白的诱导表达、纯化①重组蛋白的诱导表达：取鉴定过的１“１质粒ＭＡＧＥ—Ａ９一ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ转化入１００ｃｏｌｉＴｏｐｌｕＩ最０感受态细胞中，将菌液均匀涂布Ａｍｐ。的ＬＢ平板，３７℃倒置培养过夜，方法同前。接种Ｔｏｐｌ０／ＭＡＧＥ—Ａ９一ｐＢＡＤ／ｇｌＩＩ６由京医利大学帧上学位论文单菌落至３ｍｌＡｍｐ‘的ＬＢ液体培养基中，３７。Ｃ恒温摇床，２００ｒｐｍ振荡过夜；取过夜培养菌３０¨Ｉ接种于３ｍＬＡｍｐ７的ＬＢ液体培养基中共２管，３７℃恒温摇床，２００ｒｐｍ振荡培养约３～４ｈ；细菌浓度生长到吸光度（Ａ）值Ａ６００＝Ｏ．４～０．６时，取出１管加入左旋阿拉伯糖至终浓度为０．０２％，于３７。Ｃ恒温摇床培养，２５０ｒｐｍ诱导表达４ｈ，余下的１管为阴性对照；诱导完毕，各取ｌｍｌ样品入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，４℃离心，５０００９。１Ｏｍｉｎ，吸弃上清，收集菌体。②重组蛋白的初步鉴定：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶的配制：２％分离胶（４ｍｌ／块）浓缩胶（３ｍ１）２．１５００ｕｄｄＨ２０１．３２ｍｌ１．６０ｍｌｍ１１３０％ＡＡＴｒｉｓ—ＨＣｌ１Ｏ％ＳＤＳ１０％ＡＰ１．５Ｍ（ｐＨ８．８）１．Ｏｍｌ４０¨１４０ｕ１６“１１Ｍ（ｐＨ６．８）３８０ｕｌ３０“ｌ３０Ｕｌ５“ｌＴＥＭＥＤ２×ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ的西己制：１ＭＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ６．８）１２．５ｍｌ，ｐ一巯基乙醇１０ｍｌ，２０％ＳＤＳ２０ｍｌ，甘油２０ｍｌ，溴酚蓝０．２９，加ｄｄＨ。０定容至ｌＯＯｍｌ。煮样、上样：取５０“１样品加等体积２×ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ及ｌＯｕ１ＤＴＴ混匀，置１００℃加热５ｍｉｎ，ｔ００００ｒｐｍ，离心ｌｍｉｎ，ｕ上样１５～２０１于１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳，稳流１２ｍＡ；剥胶、染色与脱色：剥胶，于考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝Ｒ－２５００．５９，甲醇２２．５ｍｌ，冰乙酸５Ｏｍｌ，蒸馏水加至５００ｍ１）南京医科大学硕上学位论艾中慢摇３０ｍｉｎ～ｌｈ，再放入脱色液（甲醇５．０ｍｌ，冰乙酸７．Ｏｍｌ，加水至１００ｍ！）中脱色至底色透明后，观察分析重组蛋白条带有无及条带位置。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫印迹实验：Ｌｏａｄｉｎｇ取诱导表达菌体悬液１００“１加等体积２×ＳＤＳ－ＰＡＧＥＢｕｆｆｅｒ，进行１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，用预染蛋白分子量标记物做参照。电泳完毕后，剥胶，进行电转移：取一张与胶大小一致的硝酸纤维素薄膜，将其浸入电转液（Ｔｒｉｓ５．８２９，甘氨酸２．９３９，甲醇２００ｍｌ，加ｄｄＨ：０至１０００ｍ１）中至少１５ｍｉｎ，胶与硝酸纤维素膜对齐，两侧各放一层滤纸，滤纸两侧各放一层海绵，膜在正极端，胶在负极端，放入电转移仪中，加满电转液，以３００ｍＡ电泳，ｌ＿５ｈ。取出硝酸纤维素膜，用１：１０稀释的丽春红储备液（丽春红２９，三氯乙酸３０９，磺基水杨酸３０９，加ｄｄＨ：０至１００ｍｌ配成１０×贮备液）预染，提示转膜效率后，将硝酸纤维素膜置于ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ中加０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０配成ＰＢＳＴ，再加５％脱脂牛奶配成），４℃封闭过夜，用ＰＢＳＴ洗膜３次，每次慢摇１０ｍｉｎ。加一抗（用封闭液ＰＢＳＴＭ以１：１０００稀释的Ａｎｔｉ一／］ｉｓ抗体），３７℃慢摇１～２ｈ。再用ＰＢＳＴ洗膜３次，每次慢摇１０ｍｉｎ。加二抗（用ＰＢＳＴＭ以１：２００稀释的ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ），３７℃慢摇１ｈ。再用ＰＢＳＴ洗膜３次，每次慢摇１０ｍ［ｎ。加底物液（ＤＡＢ１２ｍｇ，３０％Ｈ。０：２”１，ｄｄＨ：０Ｏｍｌ），避光，显色１５ｍｉｎ，观察重组蛋白印迹条带的有无与位置等。③ＭＡＧＥ—Ａ９基因表达蛋白的初步纯化超声裂解茵体蛋白：配制菌裂缓冲液（５０ｎ，ｎｏｉ／Ｌｐ１１８．０１Ｔｒｉｓ—ｔｔＣｌ，０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，０．８５％ＮａＣｌｏ收集诱导表达４ｈ的菌体南京医科大学硕Ｌ学何论文ｌ０００ｍｌ，４℃离心，１００００９“１０ｍｉｎ，弃上清，用１×ＰＢＳ洗涤、离心１次，按湿重每１９菌加３ｍｌ菌裂解缓冲液，悬浮沉淀，反复冻融５～６次；加５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＭＳＦ３“１，１０ｍｇ／ｍｌ溶菌酶８０“１，４。Ｃ搅拌２０ｍｉｎ；置３７℃继续搅拌，当裂解物粘稠时加ＤＮａｓｅＩ２０“ｇ／ｇ湿菌，室温静置ｌｈ；冰浴中超声裂解细菌，３００瓦，１０ｓｅｃ×５０次，间歇１０ｓｅｃ；菌液变清，４℃离心，１２０００９ｘ１０ｍｉｎ，分别留取上清和沉淀，取１５～２０ｕ１，加２ｘＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ，１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，方法同上。用ＨｉＴｒａｐ亲和柱纯化变性液：Ｈｉｒｒａｐ亲和柱（商品名ＨｉＴｒａｐＣｈｅｌａｔｉｎｇＨＰ，１ａ１１）购自ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司，纯化按照说明书进行。取注射器一支，吸入５ｍｌｄｄＨ：０，接上柱的上端，去除柱的封闭末端，用５ｍｌｄｄＨ：Ｏ洗柱。然后用４｛】１ｌＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（０．０２ＭＮａ３Ｐ０４，０．５ＭＮａＣｌ，８Ｍｕｒｅａ，ｐＨ７．４）ＮｉＳＯ。与４００“１ＥＤＴＡ（Ｏ．５Ｍ）过柱，再用４ｍｌｄｄＨ：Ｏ洗柱后，用２ｍｌ过柱，再用４ｍｌｄｄＨ：０洗柱。用２ｍｌＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ过柱，取ＢｕｆｆｅｒＵＦｅａ，５ｍｌ样品以小于ｌｍｌ／ｍｉｎ速率过柱，再用４ｍ］Ｂｊｎｄ］ｎｇ过柱后，用Ｅ１ＵｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（０．０２ＭＮａ３ＰＯｑ，０．５ＭＮａＣｌ，８ＭｐＨ７．４，０．２～０．５Ｎ咪唑）１．５ｍｌ／次洗柱，以含有０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ咪唑的ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ依次洗柱，分别得到４管纯化液，同前处理样品后进行１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，分析洗脱最佳的咪唑浓度。收集纯化液，一２０℃冻存。用酶标仪测定洗脱液的Ａ２６０和Ａ：。。值，按公式计算蛋白浓度：蛋白浓度（ｍｇ／ｍ１）＝１．５ＸＡ２８０－０．７５×Ａｚｓｏ。２．制备抗ＭＡ６Ｅ－Ａ９的单克隆抗体９南京医科大学硕Ｌ学位论文２．１主要材料２．１．１实验动物：ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，６－８周龄，雌性，体重１８～２０９，由中国科学院上海实验动物中心提供。饲以标准饲料。２．１．２小鼠骨髓瘤ＳＰ２／０细胞由本试验室保存；ＲＰＭＩ一１６４０培养液、胰酶购自ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司；小牛血清（ＮＢＳ）购自Ｎａｌｇｅｎｅ公司；细胞培养板购自Ｃｏｓｔａｒ公司。２．１．３ＩｓｏＳｔｒｉｐ单抗亚型鉴定试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司。２．１．４其他常用试剂同前。２．１．５主要仪器①ＡＥ２００１／１００００电子天平ＳａｒｔｏｒｉＵＳ②ＭＥＧＡＦＵＧＥｌ．ＯＲ水平低速离心机ＨＥＲＡＥＵＳ③ＲＯＴ一１４纯水设备④倒置显微镜南京俊朗有限公司奥林巴斯奥林巴斯日本三洋⑤ＣＨ２０ＢＩＭＦ２００显微镜⑥一７０℃，一１４０℃超低温冰箱⑦ＢＢｌ６二氧化碳细胞培养箱ＨＥＲＡＥＵＳ⑧其他仪器同前２．２免疫小鼠初次免疫，抗原为纯化后浓度为０．４４６ｍｇ／ｍｌ的ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白，１００ｂｔｇ／鼠，加等体积福氏完全佐剂，用搅拌器打成油包水的乳糜状，腹腔注射，间隔２周。第二次免疫，剂量、途径同初次免疫，加福氏不完全佐剂，间隔２周。第三次免疫，剂量、途径同上，不加佐剂，１周后采小鼠眶下静脉血，ＥＬｌＳＡ法检测免癌效果。南京医科人学硕士学位论文ＥＬＩＳＡ检测：ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白纯化产物用包被液（９１１９．６碳酸盐缓冲液）稀释至终浓度１０“ｇ／ｍ１，１００“１／孔包板，４℃过夜。次日甩去包被液，０．０２５％ＰＢＳＴ洗板３次，将洗板液甩干。静脉血静置过夜，可见淡黄色透明血清析出，吸取１１ｕ１血清，加入００¨ｌ含２０％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液，混匀，加入９６孔板，同时设空白对照，３７℃孵育４０ｍｉｎ，甩去液体，同上洗板３次。加入ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ（１：１００）５０“１／孔，孵育２０ｍｉｎ，甩去液体，洗板６～８次，甩干洗板液。加入ＴＭＢ５０ｕｌ／孔，ｌ０ｍｉｎ内观察显色情况。阳性孔为蓝色，阴性孔为无色。２．３细胞融合２．３．１培养液及细胞准备：①培养液配制：ＲＰＭＩ１６４０干粉培养基，加入三蒸水４００ｍｌ，磁力搅拌器搅至完全溶解，用碳酸氢钠颗粒调ｐＨ值至７．０～７．２，加三蒸水定容至１０００ｒａｌ。无菌条件下，用０．２２“ｍ孔径滤膜的过滤器除菌，分装一２０。Ｃ保存备用。加预先灭活的ＮＢＳ至终浓度为２０％。ＮＢＳ需一２０。Ｃ保存，３７℃水浴解冻，５６℃灭活３０分钟后使用。②复苏培养细胞：取无菌试管，加６ｍｌ培养基，将从一１４０℃冰箱中取出的冻存有ｓＰ２／ｏ细胞的冻存管迅速置３７℃水浴，充分摇动，使之在ｌｍｉｎ内完全融化。放入培养基中混匀，１０００９离心５ｍｉｎ，弃上清，加６ｍｌ培养基，用吸管轻轻吹打悬浮细胞，然后将细胞悬液移入培养瓶中，置３７℃，５％ＣＯ。环境培养，次日更换培养液，继续培养。２．３．２融合：将培养瓶中准备好的对数生长期ｓＰ２／ｏ细胞冲洗下童墨堕型查兰竺土兰些丝兰来，１５００９离心５ｍｉｎ，弃上清，加ＲＰＭＩ１６４０培养液２０ｍｌ混匀，如此离心反复３次，计数细胞。经眶下静脉抽小鼠血备用，颈椎脱臼处死小鼠，置７５％酒精消毒。无菌环境取出小鼠脾脏，在筛网中磨碎，获得小鼠脾细胞，计数。将ＳＰ２／０细胞与脾细胞按１：８比例混合，在３７℃水浴中滴加５０％ＰＥＧ（分子量为４０００）０．８ｍｌ，边加边搅拌。加ＨＡＴ培养液４０ｍｌ混匀，加入两块９６孔板，每孔２００ｐ１，置３７。Ｃ５％Ｃ０２培养箱中培养。２．４检测及亚克隆观察细胞生长情况，酌情半量换液，待细胞克隆布满孔底１／ｌｏ面积时，ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清，步骤同前。将阳性孔中的细胞移出到２４孔板中扩大培养，挑选阳性最强的孔行亚克隆。冲下孔中细胞，计数，稀释，９６孔板第一排每孔１０个细胞，其余每孔１个细胞。培养至肉眼可见克隆，及时进行抗体检测。２．５单抗纯化及亚型鉴定：用ＦＰＬＣ（ｐｉｅｒｃｅ公司的ｐｒｏｔｅｉｎＬ）纯化单抗。单抗亚型鉴定应用ＩｓｏＳｔｒｉｐ单抗亚型鉴定试条，将杂交瘤细胞培养上清１：５０稀释，从中取出１５０¨ｌ加入试管，然后再加等量的新鲜稀释液入试管，室温孵育３０ｓｅｅ后快速摇匀；将单抗亚型鉴定试条插入试管中，黑端向下，５～１０ｍｉｎ后观察蓝色条带的位置。２．６ＥＬＩＳＡ及Ｄｏｔｂｌｏｔ鉴定杂交瘤上清与ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白的结合活性：以ＭＡＧＥ—Ａ９包板，加对数生长期的杂交瘤细胞培养上清孵育，上清以１：１ｏ’１：１００，１：１０００，ｌ：ｔ０２２０００稀释，加ＨＲＰ标南京医科大学蛳！ｌｊ学位论文记羊抗鼠ＩｇＧ进行ＥＬＩＳＡ检测，以免疫小鼠血清为阳性对照，ＳＰ２／０细胞培养上清为阴性对照。在硝酸纤维素薄膜上，用灭菌Ｔｉｐ压出加样孔印，使每个加样孔印直径约４ｍｍ，孔距约３ｍｍ。硝酸纤维素薄膜放在１０ｒａＭＰＢＳ液中浸透平衡３０ｍｉｎ，３７℃孵箱中烘干。在每孔印以１Ｈｌ样品液点膜，样品为ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白，以细菌空载作为阴性对照，１％ＢＳＡ为空白对照点膜。再在３７℃孵箱中烘干。将硝酸纤维素膜置于ＰＢＳＴＭ，４℃封闭过夜。用ＰＢＳＴ洗膜３次，每次慢摇１０ｍｉｎ。再在３７℃孵箱中烘干。杂交瘤培养上清作为一抗，３７℃慢摇２ｈ。再用ＰＢＳＴ洗膜３次，每次慢摇１０ｍｉｎ。加二抗（用ＰＢＳＴＭ以１：２００稀释的ｌｔＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ），３７℃慢摇１ｈ。再用ＰＢＳＴ洗膜３次，每次慢摇１０ｍｉｎ。加底物液（ＤＡＢ１２ｍｇ，３０％Ｈ：０：２“ｌ，ｄｄｔｔ：００ｍ１），避光，显色１５ｍｉｎ。３．免疫组化检测ＭＡＧＥ—Ａ９在肝癌中的表达３．１主要材料及仪器①临床标本：ＨＣＣ蜡块标本３９例，编号为１～３９，１号为１．３．１中抽提总ＲＮＡ余下的肝癌组织制备的蜡快，２～３８号取自南京医科大学第一附属医院病理科，男性３６例，女性３例，年龄３１～７４岁。均经病理诊断证实为ｔｔＣＣ。②ＡＢＣ免疫组化试剂盒购自Ｖｅｃｔｏｒ公司③切片机（Ｌｅｉｃａ），图像分析软件（Ｚｏｎｅｋｉｎｇ）其他仪器同前。３．２方法免疫组化染色按ＡＢＣ法常规操作南片【医科大学硕士学位诒文①石蜡切片厚４ｕｍ，脱蜡至水。②微波修复５ｒａｉｎ，置室温自然冷却３０ｍｉｒｌ。切片过水，０．０３％ＰＢＳＴ洗５ｍｉｎ。③将３％Ｈｚ０：均匀滴在组织上，每片１００“１，１５ｍｉｎ后过水一遍，再用ＰＢＳ洗３遍，每次５ｒａｉｎ。④２％马（二抗动物）血清每张切片１００ｕ１封闭３０ｍｉｎ。⑤加细胞培养土清（１：１，１：２，１：５，１：ｌＯ稀释，稀释液为１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）每张切片１００“１，置４℃冰箱过夜。０．０３％ＰＢＳＴ洗３遍，每次５ｍｉｎ。阳性对照为免疫小鼠血清（１：１ＯＯ稀释），阴性对照为ｓｅ２／ｏ细胞培养上清，同时设ＰＢＳ为空白对照。⑥加马抗小鼠生物素４ｔ；－二Ｅ（按试剂盒推荐浓度的１：２稀释），每张切片１００每次５ｍｉｎ。ｕｌ，置３７℃孵箱１ｈ。０．０３％ＰＢＳＴ洗３遍，⑦加ＡＢＥ复合物（按试剂盒要求，于３０ｒａｉｎ前配制，准确加１００“１试剂Ａ到１０ｍｌＰＢＳ中，然后加１００“１试剂Ｂ，立即混匀），每张切片ｌ００“１，置３７℃孵箱４０ｍｉｎ。０．０３％ＰＢＳＴ洗２遍，ＰＢＳ洗一遍，每次５ｍｉｎ。⑧ＤＡＢ显色２～１０ｍｉｎ，镜下观察出现棕色沉淀即用自来水终止反应。复染，封片。２４南京【堑科大学硕士学位论文结果１．ＭＡＧＥ—Ａ９基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果取１０“１ＰＣＲ产物，１．Ｏ％琼脂糖凝胶电泳，ＭＡＧＥ—Ａ９基因为９４５ｂｐ大小，如图１所示。１２０Ｏ０ｂｐ９４５ｂＤＯＯ０ｂｐ２●７５Ｏｂｐ５Ｏ０ｂｐ２５ＯｂｐｌＯＯｂｐ１ＭＡＧＥ—Ａ９基因扩增产物；２．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ图１ＭＡＧＥ—Ａ９基因扩增产物１．０％琼脂糖凝胶电泳结果２．ＰＣＲ产物的亚克隆将ＰＣＲ产物与ｐＭＤｌ８－Ｔ载体进行Ｔ—Ａ克隆（图２），获得ＤＭＤｌ８－Ｔ—ＭＡＧＥ－Ａ９重组体，经蓝／白斑筛选和茵液ＰＣＲ初步鉴定结果正确。３．测序结果及序列分析ＲＴ—ＰＣＲ产物测序结果如下：ＡＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＣＡＣＴＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＧＡＡＡＴＴＧ’Ｓ南京医科人学顶＋学位论义ＡＡＧＧＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＣＴＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＧＣＧＡＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴｅｅＴＧＡＴＣＡＴＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＴＧＣＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＧＡＴＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＡＣＴＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴｅＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＣＴＣＡＡＴＧＣＡＡＧＡＧＡＧＣＣＣＡ４】１ＣＴＧＣ’Ｉ’ＡＣＣＣＡ’Ｉ＇ＣＣＣ’Ｉ。’Ｉ”Ｉ。Ａ１Ｉ’ＧＡＡＧＡＧＧ。Ｉ”１１４Ｉ”】。ＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＴＣ与ＧｅｎＢａｎｋ数据库比对，同源性比较结果显示与ＭＡＧＥ—Ａ９基因序列同源性为１００％。氨基酸序列：ＭＳＬＥＱＲＳＰＨＣＫＰＤＥＤＬＥＡＱＧＥＤＬＧＬＭＧＡＱＥＰＴＧＢＥＥＥＴＴＳＳＳＤＳＫＥＥＥＶＳＡＡＧＳＳＳＰＰＱＳＰＱＧＧＡＳＳＳＴＳＶ丫ＹＴＬⅣＳＱＦＤＥＧＳＳＳＱＥＥＧＥＰＳＳＳＶＤＰＡＱＬＥＦＭＦＯＥＡＬＫＬＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＨＫＹＲＶＫＥＰＶＴＫＡＥＭＬＥＳＶＩＫＮＹＫＲＹＦＰＶＩＦＧＫＡＳＥＦＭＯＶＩＦＧＴＤＶＫＥＶＤＰＡＧＨＳＹＩＬＶＴＡＬＧＬＳＣＤＳＭＬＧＤＧＨＳＭＰＫＡＡＬＬＩＩＶＬＧＶＩＬＴＫＤＮＣＡＰＥＥＶＩＷＥＡＬＳＶＭＧＶＹＶＧＫＥＨＭＦＹＧＥＰＲＫＬＬＴＱＤＷＶＱＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰＧＳＤＰＡＨＹＥＦＬＷＧＳＫＡＨＡＥＴＳＹＥＫＶＩＮＹＬＶＭＬＮＡＲＥＰＩＣＹＰＳＬＹＥＥＶＬＲＥＥＥＥＧＶ４．ＭＡＧＥ—Ａ９基因原核表达系统的构建ｐＭＤｌ８－Ｔ－ＭＡＧＥ—Ａ９质粒和原核分泌型表达载体ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ经占ｃ胡Ｉ＋Ｈｉｚ７ｄＩＩＩ双酶切后，纯化目的片段和线性载体选行粘性末端连接，重组质粒酶切图谱显示原核分泌型表达系统～．ｐＢＡＤ／ｇＩＩ１５０００１００００堕垦垦型查堂竺生堂笪堕奎Ｉ～ＭＡＧＥ—Ａ９构建成功（图２）。ｂｐ＼ｂｐ≮１０００ｂｎ７５０ｂＤ２５０ｂｐＩＯＯｂｐ７５００ｂｐ５０００２５００ｂｐ，，Ｊｂｐ／１０００ｂｐ２５０ｂｐ————～１：ＯＬｌ５０００Ｍａｒｋｅｒ；２：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；３：ｐＭＤｉ８一Ｔ一＾（ＡＧＥ～Ａ９：４：ｐＲＡＯ／ｇＩＩ卜ＭＡＧＥ—Ａ９图２：ｐＭＤｌ８一Ｔ－ＭＡＧＥ—Ａ９及ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ－ＭＡＧＥ—Ａ９重组质粒酶切图谱５．重组蛋白的诱导表达、初步鉴定和纯化＠ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ—ＭＡＧＥ—Ａ９的表达用左旋阿拉伯糖诱导目的蛋白的表达，以空载质粒表达菌为对照，ＭＡＧＥ—Ａ９在分子量约３５ｋＤ的位置均有明显的表达条带（图３）。②重组蛋白的初步鉴定以Ａｎｔｉ—ＨｉＳ抗体为一抗，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ初步鉴定ＳｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ－ＭＡＧＥ—Ａ９（Ｈｉ６标签序列）表达产物（图４），结果显示在３５ｋＤｄ处有显色条带，证明ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白表达成功。③重组蛋白的初步纯化将包含ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ－ＭＡＧＥ－Ａ９重组体的菌体蛋白超声裂解，再用ｎｉＴｒａｐ亲和柱纯化裂解上清，１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳（图３）。提示菌体裂解上清中存在目的蛋白，在分子量约３５ｋＤ的位置有明南京医科人学硕１一学位论艾显表达条带，同时提示洗脱最佳的咪唑浓度为Ｏ。４Ｍ，洗脱液蛋白浓度为０．８２ｌｍｇ／ｍｌ。当咪唑浓度为０．５Ｍ时，洗脱液最纯，浓度也相应缩小，为０。４４６ｍｇ／ｍＬ。２３４５６７９７．４ｋＤ６６．２ｋＤ３５ｋＤ２６．６ｋＤ１４．４ｋＤ卜４：纯化的ＭＡＯＥ—ｈ９（纯化咪唑浓度从０．２Ｍ到０．５Ｍ）；５：ｒｄａｒｋｅｒ；６：空载细菌；７：诱导表达的茵体蛋白图３：ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白的表达和纯化１２３１１３ｋＤ９２ｋＤ５２‘３ｋＤ３５ｋＤ３５．３ｋＤ２８．７ｋＤ２１．３ｋＤｔ：细菌空载２：ＭＡＧＥ—Ａ９ｐｒｏｔｅｉｎ；３：Ｍａｒｋｅｒ图４：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白６．抗ＭＡＧＥ—Ａ９单抗制备、亚型及活性鉴定经３次亚克隆，获得一株能稳定分泌抗ＭＡＧＥ—Ａ９单抗的杂交瘤细胞株，ＥＬＩＳＡ检测阳性率为１００％，命名为ＡＭ９。单抗亚型南京医科大学硕上学傅论文鉴定结果为ＩｇＧ２ａ。Ｄｏｔｂｌｏｔ鉴定结果显示ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白与杂交瘤培养上清可特异性结合（图５）。ＥＬＩＳＡ检测ＡＭ９单抗效价，抗体效价达１：１０００以上。１２３１：１％ＢＳＡ点膜；２：以细菌空载点膜；３：以ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白点膜图５ＤｏｔＢｌｏｔ鉴定ＭＡＣＥ—Ａ９蛋白与杂交瘤培养上清特异性结合７．ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白在肝癌中的定位镜下观察，在癌细胞胞浆内可见棕褐色沉淀（图６），表明ＭＡＧＥ—Ａ９在ＨＣＣ中的表达主要定位于胞浆。３９例ＨＣＣ，８例有阳性表达，阳性表达率为２１％。其中高分化１０例，阳性表达２例，阳性率２０％；申度分化２５例，阳性表达４例，阳性率１６％；低分化４例，阳性表达２例，阳性率５Ｏ％。肿瘤直径＞５ｃｍ２１例，阳性表达６例，阳性表达率２９％；肿瘤直径＜Ｓｃｍ１８例，阳性表达２例，阳性表达率１１％。经Ⅳ检验，尸均＞０．０５，无统计学意义。带京医科凡学帧Ｉ．学化论丘：上图为ＭＡＧＥ—Ａ９阳性表达的ＨＣＣ细胞，胞装内见棕褐色沉淀；下图为ＩＩＣＣ阴性对照图６ＭＡＧＥ—Ａ９在ＨＣＣ中的免疫组化定位（ＡＢＣ法，。４００）南京医科大学硕Ｌ学位论文讨论尽管很早以前就有人提出了用疫苗来治疗肿瘤这一想法，但由于长期以来一直无法找到理想的肿瘤特异抗原或标记物而进展缓慢，因而能否找到合适的肿瘤抗原就成为肿瘤免疫治疗的关键问题。直到２０世纪８０年代，人们才摒弃了以往从体液免疫探索肿瘤抗原的旧思路，而从特异性细胞毒性Ｔ细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）入手。１９９１年ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ等人首次用自体ＣＴＬ识别法发现了ＭＡＧＥ－Ａ１基因，成为世界上第一个Ｔ细胞识别的人肿瘤相关抗原ｎ１。ＭＡＧＥ—Ａ１基因是ＭＡＧＥ－Ａ家族中的一个成员，此家族的１２个基因所编码的抗原不但在黑色素瘤，而且在其他多种恶性肿瘤中也均有不同程度的表达。在成年人除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达，这可能与肿瘤细胞遗传物质不稳定，甲基化调节异常有关。目前已知ＭＡＧＥ—Ａ家族所编码的蛋白与ＭＨＣ—Ｉ类分子结合后，被递呈至细胞表面而作为肿瘤抗原被识别，并最终诱导产生特异性的ＣＴＬ杀伤肿瘤细胞，因而是一种ＣＴＬ介导的特异性肿瘤免疫治疗的理想靶分子”１。另有报道称ＭＡＧＥ一基因不但能激发细胞免疫，也能诱导体液免疫…，所以在过去的１０多年中，ＭＡＧＥ－Ａ分子被视为肿瘤免疫治疗的理想工具而受到了广泛关注。关于ＭＡＧＥ－Ａ亚家族成员应用于肿瘤治疗的探索性研究也很多，如应用ＭＡＧＥ—ｈｌ基因，采取不同策略进行肿瘤免疫治疗取得了一些进展：①用ＭＡＧＥ—Ａ１抗原肽疫苗诱导扩增特异性ＣＴＬ进行过继免疫治疗¨１；②用人工合成的抗原肽脉冲处理树突状细胞（ＤＣ）或用ＭＡＧＥ—Ａ１基因修饰的Ｄｃ制成Ｄｃ疫苗，对肿瘤患者进行免疫治疗¨１。而在最近的临床研究中，在给已有转移的黑色素瘤患者进行ＭＡＧＥ—Ａ３抗原肽注射治疗后，不仅南京医科大学坝士学位论文观察到可明显抑制肿瘤生长，有的患者甚至保持了２年以上的无瘤状态¨“”１。但有些情况可能会限制ＭＡＧＥ—Ａ基因的应用，如异质性表达问题（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ），在部分患者表达不够强或者根本不表达以至不能诱发有效的免疫反应，而且能否诱导出特异性免疫反应还受ＨＬＡ分子的限制。所以理论上讲多价瘤苗的效果要好于单一瘤苗，因为前者可避免因抗原异质性表达和某一种抗原的丢失而导致治疗无效。因此，有必要研究其他ＭＡＧＥ－Ａ基因在ＨＣＣ中的表达。ＭＡＧＥ－Ａ９是ＭＡＧＥ—Ａ家族成员，由于ＭＡＧＥ－Ａ家族成员之问的高度同源性，ＭＡＧＥ—Ａ９同其他ＭＡＧＥ—Ａ基因一样表达于人多种恶性肿瘤细胞，包括皮肤Ｔ细胞淋巴瘤＂１、与食管腺癌相关的ＢａｒｒｅｔｔＳ发育不良¨０１等，在正常组织中仅睾丸和胎盘有表达，因此有理由推测其可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。但是长期以来，关于ＭＡＧＥ基因在各种肿瘤和正常组织中的表达研究主要是通过ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｉｏｔ在ＲＮＡ水平进行，有关ＭＡＧＥ—Ａ９的研究也不例外，单克隆抗体的缺乏使得目前无法对ＭＡＧＥ—Ａ９进行蛋白水平的研究，国内外也没有关于ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白定位和表达的研究报道。本文通过克隆、表达ＭＡＧＥ—Ａ９基因，制备特异性单克隆抗体，观察ＭＡＧＥ—Ａ９抗原在ＨＣＣ中的表达和细胞定位。本研究首先合理设计引物，应用ＲＴ—ＰＣＲ从人ＨＣＣ总ＲＮＡ中扩增出ＭＡＧＥ—Ａ９基因，并经序列分析证实。ＲＴ—ＰＣＲ法是获得特定基因的最常用、也最方便的方法，为了在人ＨＣＣ组织总ＲＮＡ提取的过程中，尽量避免ＲＮＡ酶的污染，本文应用ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ一步法，省时、简便，得到了较高产量的总ＲＮＡ。ｐＭＤｌ８－Ｔ载体是利用常用于ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ聚合酶使扩增产物３’端多加一个南京医科大学顾｝学位论义脱氧腺苷酸的特性而设计的“３１”１，它不仅大大提高了连接效率，同时减少了自身连接现象“”。所以应用ｐＭＤｌ８一Ｔ载体作为克隆载体以及后序的测序鉴定，虽然在引物两端没有设计限制性内切酶位点，但是能保证获得正确目的基因序列。基因重组生产的关键在于适当表达系统的选择。原核大肠杆菌细胞是基因工程蛋白表达的常用系统，本文选用分泌型原核表达载体ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ旨在获得可溶性的活性蛋白，载体的构建流程如图７。用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ＿ＭＡＧＥ—Ａ９的表达产物，分子量约３５ｋＤ，与构建的基因相符，超声裂解菌体的上清中亦可见目的蛋白条带，提示ＭＡＧＥ—Ａ９在细菌质周腔内获得了可溶性表迭。由于ｐＢＡＤ／ｇｌＩＩ有ｃ一末端的多聚组氨酸（ｐｏｌｙ－Ｈｉｓ）。标签序列，所以本丈使用能特异性结合Ｈｉｓ标签序列的ＨｉＴｒａｐ亲和柱，纯化目的蛋白，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳结果显示在３５ｋＤ处出现单一条带，提示ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白纯化满意，为制备抗ＭＡＧＥ—Ａ９单克隆抗体提供了必备条件。。一一Ｈ∽∞然爸静群纛南京医科大学硕上学位论文图７．１ｔ，，ｊｄＨＩ上图为ｐＢｌ｝１８一Ｔ载体结构中图为ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ载体结构下图为ｐＭＤｌ８一Ｔ－ＭＡＧＥ—Ａ９克隆载体和ｐＢＡＯ／ｇＩＩＩ—ＭＡＧＥ—Ａ９重组表达质粒的构建流程本研究随后应用杂交瘤技术制备抗ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白的单克隆抗体。经三次亚克隆，获得一株能稳定分泌抗ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白单抗的杂交瘤细胞，命名为ＡＭ９，Ｄｏｔｂｌｏｔ鉴定其细胞培养上清能特异性结合ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白，ＥＬＩＳＡ检测效价在１：ｌ０００以上，亚型鉴定结果为ＩｇＧ２ａ型。本研究在国内外首次制备了抗ＭＡＧＥ—Ａ９单抗，为研究ＭＡＧＥ－Ａ９在ＨＣＣ中的表达奠定了基础。本研究最后应用免疫组化法检测ＭＡＧＥ—Ａ９在ＨＣＣ中的表达和细胞定位。免疫组化是在蛋白水平检测抗原表达的常用方法，不但可以定性，而且可以直观表现抗原的定位。由于１号片的组织≈４南京医科大学顿上学位论文和提取总ＲＮＡ的组织来自同一个病例，所以理论上１号片应为阳性反应，故以此为阳性参照片。本研究结果显示ＭＡＧＥ—Ａ９在ＨＣＣ中的表达定位于癌细胞胞浆，３９例ｌｔＣＣ，有８例阳性表达，阳性率为２１％。提示ＭＡＧＥ—Ａ９在ＨＣＣ中有一定的表达，可能成为ＨＣＣ免疫治疗的潜在靶点。至今为止有关ＭＡＧＥ－Ａ细胞定位的报道很不充分，且研究结果不一，或定位于胞浆，或定位于胞核，或两者兼有，如ＭＡＧＥ－Ａ１、Ａ３位于胞浆，而ＭＡＧＥ—ｈｌ０、ｈｌｌ则主要位于胞核¨“，所以ＭＡＧＥ—Ａ的细胞定位机制仍很不明了。仅有推测这样的细胞内定位变化可能是因为ＭＡＧＥ蛋白可穿行于胞浆和胞核，但也可能与各种蛋白具有不同的功能有关，本研究结果提示ＭＡＧＥ—Ａ９蛋白主要存在于胞浆中，可能与其具有的功能有关。与ＭＡＧＥ—Ａ细胞定位不同，以往ＭＡＧＥ—Ａ基因在恶性肿瘤表达的研究却非常多，但是研究结果之间的分歧也很多。至今已经有报道ＭＡＧＥ—Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６和Ａ１２基因在许多不同肿瘤中都有ｍＲＮＡ的表达¨６。２“，Ｇｏｔｏｈ等¨２３研究非小细胞肺癌（ＮＳＣＬＣ），ＭＡＧＥ—Ａ１和ＭＡＧＥ—Ａ３ｍＲＮＡ的表达率分别为１８／５５（３３％）和２３／５５（４２％）。有关ＭＡＧＥ－Ａ基因在消化系统肿瘤表达的报道亦不少见，邵莹等¨川发现在８３例消化道肿瘤中共有４５例（５４％）表达ＭＡＧＥ—Ａ１、Ａ２或Ａ３中的一种；赵海涛ｈ４１等发现在３１例ＨＣＣ中ＭＡＧＥ—ｈｌ０基因的阳性表达率为３８．７％。不同学者的研究结果有时差异很大，Ｓｈｉｃｈｉｊｏ等¨５１在讨论这种差异时认为其可能的原因是：①研究的肿瘤标本处于不同的癌症进展阶段，癌症晚期可能使ＭＡＧＥ的表达更高；②应用的ＰＣＲ条件不完全相同；③由于不同人种表达的ＨＬＡ分子类型不尽相同，也会导致ＭＡＧＥ基因的表达南京医科大学顺十学位论义不同。本研究首次报道ＭＡＧＥ－Ａ９在ＨＣＣ中的表达，阳性率为２１％，提示ＭＡＧＥ－Ａ９在ＨＣＣ中有一定表达，有可能成为ＨＣＣ免疫治疗的备选靶分子。虽然有关ＭＡＣＥ—Ａ基因在恶性肿瘤中表达的研究结果很多，但是由于特异性单克隆抗体的缺乏，大多研究都集中在基因水平。而ｍＲＮＡ水平的ＭＡＧＥ—Ａ基因阳性表达并不等于ＭＡＣＥ—Ａ抗原（蛋白质水平）的表述，只有ＭＡＧＥ—Ａ抗原的表达，才可诱导肿瘤细胞的免疫反应。本研究用单克隆抗体进行ＭＡＧＥ－Ａ９抗原的检测，也正是考虑肿瘤抗原表达之后，才可诱导机体的抗肿瘤免疫反应。只有ＭＡＧＥ－Ａ９蛋白水平阳性表达的病例，才可能适于进行基于ＭＡＣＥ—Ａ９基因的特异性免疫治疗。但是相比其他作者的研究结果，本文２１％的阳性表达率较低，作者认为原因可能为：①以往研究以ＲＴ—ＰＣＲ法检测基因水平表达居多，而本实验采用的是免疫组化法。研究表明，ｍＲＮＡ的表达并不等于蛋白水平的表达，所以在方法上可能会存在差异；②病例代表性不足，本实验标本数量较少，且多为中度分化肿瘤，高分化和低分化肿瘤较少；③人群区域分布也可能有差异。本研究还发现ＭＡＣＥ－Ａ９的阳性表达与肿瘤大小和分化程度等病理指标之间无统计学相关性。推测ＭＡＧＥ—Ａ９基因有可能是由原癌基因启动的一个静止基因，与细胞分化和螬殖无关。以往有关ＭＡＧＥ—Ａ基因在恶性肿瘤中的表达与Ｉ隆床病理指标相关性的研究很多，但存在不少分歧。Ｆｕｊｉｅ等研究表明，胃癌组织中ＭＡＧＥ的表达与临床病理因素无相关性¨“，但Ｋａｔａｎｏ等却发现ＭＡＧＥ—Ａ１的表这与胃癌浸润深度及分期显著相关，分期越晚，肿瘤浸润越深，ＭＡＣＥ—Ａ１的表达率就越高¨”。目前多数国外的研究结果认同南京医科大学硕十学位论文这种相关性，然而国内的研究多认为ＭＡＧＥ基因的表达与ｔ临床病理指标无相关性。赵海涛等研究了ＭＡＣＥ—Ａ１０在肝癌中的表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、门脉癌栓、肿瘤包膜完整性、肿瘤单发或多发、ＨＢＶ及ＨＣＶ感染、ＡＦＰ指标、生存期长短及转移复发等临床病理指标是否相关进行了统计学分析，研究结果显示ＭＡＧＥ—Ａ１０基因在肝癌中的表达与上述临床病理指标之间无统计学相关性¨“。任秀宝等研究了ＭＡＧＥ—Ａ１、Ａ２、Ａ３基因在５种消化道上皮肿瘤的表达，统计分析结果显示ＭＡＧＥ基因的表达与患者年龄、性别、临床分期等无关¨…。这种差异可能与实验标本的来源人种、样本数、实验方法的敏感性以及实验者的主观性都有一定关系。本研究结果显示ＭＡＧＥ—Ａ９表达与肿瘤大小及分化程度无关，提示针对ＭＡＧＥ－Ａ９的免疫治疗不受肿瘤大小及分化程度的影响。南京医科大学硕士学位论史研究小结１．Ｊ，ｋＨＣＣ组织中抽提总ＲＮＡ，设计引物扩增ＭＡＧＥ—Ａ９基因，经克隆、测序鉴定其序列，与ＧｅｎＢａｎｋ数据库比对，证明为９４５ｂｐ的目的基因。２．构翼：［ＭＡＧＥ—Ａ９基因的分泌表迭系－ｇｔｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ—ＭＡＧＥ－Ａ９，分离可溶性表达产物，鉴定并成功纯化分子量为３５ｋＤ目的蛋白。３．制备抗ＭＡＧＥ—Ａ９的单克隆抗体，抗体亚型为ＩｇＧ２ａ，能与ＭＡＧＥ—Ａ９抗原特异性结合，效价在１：１杂交瘤细胞株ＡＭ９。０００ｐ７，上，从而获得稳定４．检测３９倒ｔ临床确诊ｌｉｃｅ的蜡快，细胞定位主要在胞浆。３９例中８例阳性表达，阳性率为２１％，其中高分化１０４，，１，阳性表达２例，阳性率２０％；中度分化２５例，阳性表达４例，阳性率１６％；低分化４例，阳性表达２例，阳性率５０％。肿瘤直径＞５ｃｍ２１例，阳性表达６例，阳性表达率２９％；肿瘤直径＜５ｃｍ１８例，阳性表达２例，阳性表达率１１％，经口检验，证实ＭＡＧＥ—Ａ９的表达与肿瘤大小及分化程度无统计学相关性。南京医科大学硕｝学位论文［参考文献］１．汤小兰，恶性肿瘤流行病学，流行病学，张开金主编，南京，东南大学出版社２００３；２３４２．ＶａｎＤｅｒＢｒｕｇｇｅｎｐ．，Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ．Ｃ．，Ｃｈｏｍｅｚ，ＰＩ，ｅｔａ１．ＡｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｈｕｍａｎａｎａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙｃｙｔｏｌｙｔｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｏｎａｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９１，２５４（５０３８）：１６４３－７．Ｍｕ幻ｅｎＧＮ．Ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ—３．ＺｅｎｄｍａｎＡＪ，ＲｕｉｔｅｒＤＪ，Ｖａｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ，ａｎｄｐｕｔａｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００３，１９４（３）：２７２－２８８．４．ＰａｒｋＪＨ，ＫｉｍＣＪ，ＬｅｅＪＨ，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆｃａｒｌｃｅｒｂｙＤＮＡｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．ＭｏｌＣｅｌｌｓ．１９９９，９（４）：３８４—９１．５．ＴｏｓｏＪＦ，ＯｅｉＣ，ＯｓｈｉｄａｒｉＦ，ｅｔａ１．ＭＡＧＥ一１一ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ—ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍａｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｇｅｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９６，５６（１１：１６．６．ＴｈｕｒｎｅｒＢ，ＨａｅｎｄｌｅＩ，ＲｏｄｅｒＣ，ｅｔａ１．ＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＭＡＣＥ一３Ａ１ｐｅｐｔｉｄｅ－ｐｕｌｓｅｄｍａｔｕｒｅ，ｍｏｎｏｃｙｔｅ—ｄｅｒｉｖｅｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｅｘｐａｎｄｓｓｐｅｃｉｆｉｃｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｓａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎａｄｖａｎｃｅｄｓｔａｇｅＩＶｍｅｌａｎｏｍａ．ＪＥｘｐＭｅｄ．１９９９，１９０（１１）：１６６９·７８．７．ＧｉｌｌｅｓｐｉｅＡＭ。ＣｏｌｅｍａｎｃａｎｃｅｒＲＥ．ＴｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎＴｒｅａｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ２２７．ｔｈｅｒａｐｙ．ＣａｎｃｅｒＲｅｖ，１９９９，２５（４）：２１９＿８．耿淼，昊玉章，等．肿瘤抗原ＭＡＧＥ—Ａ家族成员进化关系的初步研究．中国免疫学杂志，２００２，１８（５）：３４１—３４４９．ＬｉｎＪ．ＬｉｎＬ，ＴｈｏｍａｓＤＧｅｔａ１．Ｍｅｌａｎｏｍａ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＡｎｔｉｇｅｎｓｉｎｏｆＮｏｖｅｌＭＡＧＥ·Ａ１０Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＥｓｏｐｈａｇｅａｌ３９南京医科人学硕士学位论文ＳｐｌｉｃｅＶａｒｉａｎｔｓ．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，２００４．１０（１７）：５７０８—１６。１０．ＥｉｃｈｍｕｌｌｅｒＳ，ＵｓｅｎｅｒＤ，ＴｈｉｅｌＤ，ｅｔａ１．Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｓｉｎｃｕｔａｎｅｏｕｓＴ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｅｒｏ—ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ。ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ，２００３，１０４（４）：４８２—７．１ｌ，Ｍ，ＷｅｙｎａｎｔｓＰ，ＲａｎｋｉｎＥ，ｅｔａ１．ＴｕｍｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎａｍｅｌａｎｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓｍｅａｔｅｄｗｉｔｈｐｅｐｔｉｄｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙｇｅｎｅＭＡＧＥ－－３ａｎｄｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．８８５．１２．Ｍａｒｃｈａｎｄｂｙ瑚。Ａ－Ａｌ。ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ，１９９５，６３（６）：８８３Ｍ，ｖａｎＢａｒｅｎＮ，ＷｅｙｎａｎｔｓＰ，ｅｔａ１．ＴｕｍｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｅｔａｓｔａｔｉｃｍｅｌａｎｏｍａｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙｇｅｎｅＭＡＧＥ２３ａｎｄｐｒｅｓｅｎｔｅｄｂｙＨＬＡ—Ａ１．ＩｎｔＪ１３．ＪａｍｅｓＣａｎｃｅｒ，１９９９，８０（２）：２１９—２３０．ｒｅａｃｔｉｏｎｓＭＣ．Ｎｏｖｅｌｎｏｎ—ｔｅｍｐｌａｔｅｄｎｕｃｌｅｏｆｉｄｅａｄｄｉｔｉｏｎｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９８８，１６（２０）：９６７７Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，２０（１）：２０一２２１４．ＨａｄｉｅｂＮ，ＢｅｒｋｏｗｉｔｚＧＡ：Ｂｉｏ１５．ＲｏｂｌｅｓＪ，Ｄｏｅｒｓ１６．ＥｕｒａＭ：ＰｒｏｍｅｇａＮｏｔｅｓ，１９９４，４５：１９－２０ｇｅｎｅｓＭ，ＣｈｉｋａｍａｔｓｕＫ，ＯｇｉＫ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＧＥ．１，一２ａｎｄ一３ｂｙｈｕｍａｎｍａｘｉｌｌａｒｙｃｅｌｌｓ．ＡｎｆｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９５，１５：５５—５９．１７．ＥｕｒａＭ，ＣｈｉｋａｍａｔｓｕＫ，ＯｇｉＫ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＧＥｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｈｕｍａｎｈｅａｄ－ａｎｄ—ｎｅｃｋｓｑｕａｍｏｕｓ—ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｌｎａｓ。ＩｎｔＪＣａｎｃｅｇ１９９５，６４：３０４－３０８．１８．ＨＪ，ＹａｎｇＹＦｕｊｉｅＴ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＭＡＧＥｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｈｕｍａｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９７，１７：３５５９－－３５６３１９。ＹｏｓｈｉｍａｔｓｕＴ，ＹｏｓｈｉｎｏＩ，ＯｈｇａｍｉＡ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ—ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｉｎｈｕｍａｎｌｕｎｇ０ｎｃｏｌ，１９９８，６７：１２６—１２９ｃａｎｃｅｒ．ＪＳｕｒｇ南京医科大学顾十学位论文２０．ＨａｓｅｇａｗａＨ，Ｍ州Ｍ，ＨａｒａｇｕｃｈｉＭ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ－ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＡｒｃｈＰａｔｈｏｌＬａｂＭｅｄ．１９９８，１２２：５５１～５５４．２１．ＴａｈａｒａＫ，ＭｏｒｉＭ，ＳａｄａｎａｇａＮ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＭＡＧＥｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｔａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，１５；８５：１２３４。１２４０．２２．ＧｉｌｌｅｓｐｉｅＡＭ，ＣｏｌｅｍａｎＲＥ．Ｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．ＣａｎｃｅｒＴｒｅａｔＲｅｖ，Ｉ９９９，２５（４）：２１９－２２７．２３．邵莹，刘海燕，李慧，等．ＭＡＧＥ—ｌ、一２、一３基因在消化道肿瘤中的表达．中国免疫学杂志，２００１，１７：３３～３５２４．赵海涛，芮静安，赵屹等．ＭＡＧＥ－１０基因在肝细胞肝癌中的表达，Ｋ，ｌｇ床意义。中国微创外科杂志２００２，２（６）：４１９—４２１２５．ＳｈｉｃｈｉｊｏＳ，ＨａｙａｓｈｉＡ，ＴａｋａｍｏｒｉＳ，ｅｔａ１．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭＡＧＥ－４ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｓ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ，１９９５，６４：１５８～１６３２６．Ｋａ打ｎＯｈｍａｎＦｏｒｓｈｍｄ。ＫａｔａｒｉｎａＮｏｒｄｑｖｉｓｔ．Ｔｈｅｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｇｅｎｅｓ—ＡｎｙｃｌｕｅｓｔＯｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ？ＪＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ，２００１，２６５（２）：１８５－１９４２７．ＫａｔａｎｏＭ，ＮａｋａｎｕｒａＭ，ＭｏｆｉｓａｋｉＴ，ｅｔａ１．Ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ－ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅ一１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｉｎｖａｓｉｖｅｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｔａｇｅｏｆｄｉｓｅａｓｅ．ＪＳｕｒｇＯｎｃｏ，１９９７，６４：１９５—２０１２８．任秀宝，邵莹，徐琪，等．ＭＡＧＥ在５种上皮性肿瘤中的表达特点．中国肿瘤临床２００１，２８（１０）：７４３—７４５４ｌ南京医科大学顺七学位论文附录：本文所参考Ｇｅｎｂａｎｋ中ＭＡＧＥ．Ａ９基因序列趟３１Ｑ３２§．Ｒ迎ｏｒｔｓＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＬＯＣＵＳｍｅｌａ…［ｇｉ：３２４４２２０３】坠ｍＲＮＡ１ｉｎｅａｒＰＲＴ０８．肌．２００３ＶＥＲＳＩｏＮＡＹ３１０３２５９４５ｂｐＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙＡ９（ＭＡＧＥＡ９１ｍＲＮＡ，ｐａｒｔｉａｌｃｄｓ．ＡＣＣＥＳＳｌ０ＮＡＹ３１０３２５ＤＥＦＩＮｎｌ０ＮＡＹ３１０３２５．１Ｇ１：３２４４２２０３ＫＥＹＷＯＲＤＳＳＯＵＲＣＥＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ｈｕｍａｎ）０ＲＧＡＮｌＳＭＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓＥｕｋａｒｙｏｔａ；Ｍｅｔａｚｏａ；Ｃｈｏｒｄａｔａ；Ｃｒａｎｉａｔａ；Ｖｅｒｔｅｂｒａｔａ；Ｅｕｔｅｌｅｏｓｔｏｍｉ；Ｍａｍｍａｌｉａ；Ｅｕｔｈｅｒｉａ；Ｅｕａｒｃｈｏｎｔｏｄｉｒｅｓ；Ｐｒｉｍａｔｅｓ；Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ；Ｈｏｍｉｎｉｄａｅ；Ｈｏｍｏ．ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ１（ｂａｓｅｓ１ｔｏ９４５１Ｚｈｕ，Ｊ．，Ｆｅｎｇ，Ｚ．ａｎｄＧｕａｎ，Ｘ．ＴＩＴＬＥⅣ【ＡＧＥ．９ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＡＧＥ９）ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓＪＯＵＲＮＡＬＲＥＦＥＲＥＮＣＥＡＵＴＨＯＲＳＵｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄＡＵＴＨＯＲＳ２（ｂａｓｅｓ１ｔｏ９４５）Ｚｈｕ，Ｊ．，Ｆｅｎｇ，Ｚ．，Ｇｕａｎｇ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｊｉａｏ，Ｙ．，Ｔａｏ，Ｋ．ａｎｄＺｈａｎｇ，Ｊ．ＴＩＴＬＥＤｉｒｅｃｔＳｕｂｍｉｓｓｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅｄ（３０—ＭＡＹ一２００３１ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＨａｎｚｈｏｎｇＲｏａｄ１４０，Ｎａｎｊｉｎｇ，ＪｏＵＲＮＡＬＪｉａｎｇｓｕ２ｌ００２９．Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａＦＥＡＴＵＲＥＳｓｏｕｒｃｅＬｏｃａｔｉｏｎ／Ｑｕａｌｉｆｉｅｒｓ１—９４５／ｏｒｇａｎｉｓｍ＝”Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ”／ｍ０１ｔｙｐｅ＝”ｍＲＮＡ”／ｉｓｏｌａｔｉｏｎｓｏｕｒｃｅ＝”ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓ”／ｄｂｘｒｅｆ＝－”ｔａｘｏｎ：９６０６”／ｔｉｓｓｕｅｔｙｐｅ＝”ｌｉｖｅｒ”盛ｉ盟ＣＤＳ１．．＞９４５７Ｒｅｎｅ＝”ＭＡＧＥＡ９”１．．＞９４５＆ｅｎｅ＝”ＭＡＧＥＡ９”／ｃｏｄｏｎｓｔａｒｔ＝ｌ／ｐｒｏｄｕｃｔ＝”ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙＡ９”／ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｉｄ一’△△旦８２１Ｚ！：ｌ”／ｄｂｘｒｅｆ＝－”ＧＩ：３２４４２２０４”南京医科人学硕士学位论文／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＝’’ＭＳＬＥＱＲＳＰＨＣＫＰＤＥＤＬＥＡＱＧＥＤＬＧＬＭＧＡＱＥＰＴＧＥＥＥＥＴＴＳＳＳＤＳＫＥＥＥＶＳＡＡＧＳＳＳＰＰＱＳＰＱＧＧＡＳＳＳＩＳＶＹＹＴＬＷＳＱＦＤＥＧＳＳＳＱＥＥＧＥＰＳＳＳＶＤＰＡＱＬＥＦⅣ咋ＯＥＡＬＫＬＫＶＡＥＬＶＨＦＬＬＨＫＹＲＶＫＥＰＶＴＫＡＥⅣ【ＬＥＳＶＩＫＮＹＫＲＹＦＰＶＩＦＧＫＡＳＥＦＭＯＶＩＦＧＴＤＶＫＥＶＤＰＡＧＨＳＹＩＬＶＴＡＬＧＬＳＣＤＳＭ皿ＧＤＧＨＳＭ口ＫＡＡＬＬⅡＶＬＧＶＩＬＴＫＤＮＣＡＰＥＥＶＩＷＥＡＬＳＶＭＧＶＹＶＧＫＥＨⅣ呼ＹＧＥＰＲＫＬＬＴＯＤＷＶＯＥＮＹＬＥＹＲＱＶＰＧＳＤＰＡＨＹＥＦＬＷＧＳＫＡＨＡＥＴＳＹＥＫＶ【ＮⅥ，ＶＭ儿ＮＡＲＥＰＩＣＹＰＳＬＹＥＥＶＬＲＥＥＥＥＧＶ”ｖａｒｉａｔｉｏｎ９／ｇｅｎｅ＝”ＭＡＧＥＡ９”／ｎｏｔｅ＝”ｃｏｍｐａｒｅｄＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＵ６６０８３”ｖａｒｌａｔｔｏｎｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｐｏｓｉｔｅｄｉｎ／ｒｅｐｌａｃｅ２”Ｃ”２６６／ｇｅｎｅ＝”ＭＡＧＥＡ９”／ｎｏｔｅ＝”ｃｏｍｐａｒｅｄＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＵ６６０８３”／ｒｅｐｌａｃｅ＝＂ａ”６２７ｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｐｏｓｉｔｅｄｉｎＶａｒｌａｔｌＯｎ／ｇｅｎｅ＝＇＇ＭＡＧＥＡ９”／ｎｏｔｅ＝”ｃｏｍｐａｒｅｄＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＵ６６０８３”／ｒｅｐｌａｃｅ２”ａ”６７０ｔＯｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｐｏｓｉｔｅｄｉｎ／ｇｅｎｅ＝＇＇ＭＡＧＥＡ９”／ｎｏｔｅ＝’。ｃｏｍｐａｒｅｄＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＵ‘６６０８３”ｖａｒｉａｔｉｏｎｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｐｏｓｉｔｅｄｉｎ／ｒｅｐｌａｃｅ＝”ｔ”９２５／ｇｅｎｅ＝”ＭＡＧＥＡ９”／ｎｏｔｅ＝”ｃｏｍｐａｒｅｄＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＵ６６０８３”／ｒｅｐｌａｃｅ３”ｇ”ｔＯｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｐｏｓｉｔｅｄｉｎ０Ｒ【Ｇ烈４３南京医科大学领士学位论文１ａｔｇｔｃｔｃｔｔｇａｇｃａｇａｇｇａｇｔｃｃｇｃａｃｔｇｃａａｇｃｃｔｇａｔｇａａｇａｃｃｔｔｇａａｇｃｃｃａａｇｇａ６１ｇａｇｇａｃｔｔｇｇｇｃｃｔｇａｔｇｇｇｔｇｃａｃａｇｇａａｃｃｃａｃａｇｇｃｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇａｃｔａｃｃｔｃｃ１２ｌｔｃｃｔｃｔｇａｃａｇｃａａｇｇａｇｇａｇｇａｇｇｔｇｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｇｔｃａｔｃａａｇｔｃｃｔｃｃｃｃａｇａｇｔ１８１ｃｃｔｃａｇｇｇａｇｇｃｇｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃａｔｔｔｃｃｇｔｃｔａｃｔａｃａｃｔｔｔａｔｇｇａｇｃｃａａｔｔｃｇａｔ２４１ｇａｇｇｇｃｔｃｃａｇｃａｇｔｃａａｇａａｇａｇｇｇａｇａｇｃｃａａｇｃｔｃｃｔｃｇｇｔｃｇａｃｃｃａｇｃｔｃａｇｃｔｇ３０１ｇａｇｔｔｃａｔｇｔｔｃｃａａｇａａｇｃａｃｔｇａａａｔｔｇａａｇｇｔｇｇｃｔｇａｇｔｔｇｇｔｔｃａｔｔｔｃｃｔｇｃｔｃ３６１ｃａｃａａａｔａｔｃｇａｇｔｃａａｇｇａｇｃｃｇｇｔｃａｃａａａｇｇｃａｇａａａｔｇｃｔｇｇａｇａｇｃｇｔｃａｔｃａａａ４２１ａａｔｔａｃａａｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｃｃｔｇｔｇａｔｃｕｃｇｇｃａａａｇｃｃｔｃｃｇａｇｔｔｃａｔｇｃａｇｇｔｇａｔｃ４８１ｔｔｔｇｇｃａｃｔｇａｔｇｔｇａａｇｇａｇｇｔｇｇａｃｃｃｃｇｃｃｇｇｃｃａｃｔｃｃｔａｃａｔｃｃｔｔｇｔｃａｃｔｇｃｔ５４１ｃｔｔｇｇｃｃｔｃｔｃｇｔｇｃｇａｔａｇｃａｔｇｃｔｇｇｇｔｇａｔｇｇｔｃａｔａｇｃａｔｇｃｃｃａａｇｇｃｃｇｃｃｃｔｃ６０１ｃｔｇａｔｃａｔｔｇｔｃｃｔｇｇｇｔ酉ｇａｔｃｃｔｇａｃｃａａａｇａｃａａｃｔｇｃｇｃｃｃｃｔｇａａｇａｇｇｔｔａｔｃ６６１ｔｇｇｇａａｇｃｇｃｔｇａｇｔｇｔｇａｔｇｇｇｇｇｔｇｔａｔｇｔｔｇｇｇａａｇｇａｇｃａｃａｔｇｔｔｃｔａｃｇｇｇｇａｇ７２１ｃｃｃａｇｇａａｇｃｔｇｃｔｃａｃｃｃａａｇａｔｔｇｇｇｔｇｃａｇｇａａａａｃｔａｃｃｔｇｇａｇｔａｃｃｇｇｃａｇｇｔｇ７８１ｃｃｃｇｇｃａｇｔｇａｔｃｃｔｇｃｇｃａｃｔａｃｇａｇｔｔｃｃｔｇｔｇｇｇｇｔｔｃｃａａｇｇｃｃｃａｃｇｃｔｇａａａｃｃ８４１ａｇｃｔａｔｇａｇａａｇｇｔｃａｔａａａｔｔａｔｔｔｇｇｔｃａｔｇｃｔｃａａｔｇｃａａｇａｇａｇｃｃｃａｔｃｔｇｃｔａｃ９０ｌｃｃａｔｃｃｃｔｔｔａｔｇａａｇａｇｇｔｔｔｔｇａｇａｇａｇｇａｇｇａａｇａｇｇｇａｇｔｃ４４南京医科人学硕士学位论文致谢对导师冯振卿教授和课题组管晓虹教授在学习、生活上的关心、支持、帮助、指导表示诚挚的感谢。通过三年的学习、研究生活，在治学和做人方面都从两位老师身上学到很多。衷心感谢实验室仇镇宁老师、李玉华老师、彭韬老师在试验技术上的指导和帮助。感谢本实验室及病理学教研室的朱毅、赵文娥、丁贵鹏、孙景军、王子露、刘宜君，贡其星等同学，焦永军博士，刘悦芳博士，感谢病理教研室的李芸茜、江汕、印虹、王耀清、周世一、刘宁波等老师，任勇亚副教授，冷静教授，第一附属医院病理科范钦和教授和江苏省肿瘤医院徐玮医师等同学和老师在具体试验、学习上给予的大量支持，同时还要感谢许宁、吴玉龙同学、段磊老师对我学习工作和生活的帮助。特别感谢本课题组朱进博士，三年的学习生活，朱博士同时作为朋友、师兄、老师三种身份，给予大量的指导和帮助。最后还要深深感谢我的亲人，朋友三年以来对我的默默支持和无私奉献。南京医科大学颂十学位论文［综述】肿瘤特异性抗原ＭＡｒｉＥ家族的研究进展ＭＡＧＥ（ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ），即黑色素瘤抗原，是近年来发现的一种肿瘤抗原基因家族。ＭＡＧＥ家族的很多基因在多种恶性肿瘤中都有不同程度的表达，而在成人正常组织中除睾丸和胎盘外均不表达。同时，ＭＡＧＥ基因编码的抗原在细胞内经加工产生抗原肽，并与ＨＬＡ一１类分子结合形成复合物，可被自体细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）识别，诱导其在相应肿瘤细胞的特异性杀伤。故而，ＭＡＧＥ基因逐渐成为一种ＣＴＬ介导的肿瘤特异性治疗的靶标。一、ＭＡＧＢ基因定位及其蛋白结构１９９１年，ｖｅｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ¨１等人首次用自体ＣＴＬ识别法发现了ＭＡＧＥ一１基因，其随即成为世界上第一个Ｔ细胞识别的人肿瘤相关抗原。随后的一些深入研究发现，ＭＡＧＥ—Ａ１编码的抗原ＭＺ２一Ｅ不但在黑色素瘤，在其他多种恶性肿瘤中均有不同程度的表达，而在成年人除睾丸和胎盘外的正常组织申均不表达。在进一步研究中，越来越多的同源基因被发现，人们逐渐认识到，ＭＡＧＥ基因并非单一的基因，而是一个庞大的基因家族。这个基因家族有一些共同的特点：定位于ｘ染色体；特异性的表达于多种恶性肿瘤及正常睾丸和胎盘；有一个开放阅读框（ＯＲＦ），所编码的蛋白Ｃ端含有约２ｏｏ个氨基酸残基的同源序列。根据不同ＭＡＧＥ基因在Ｘ染色体上的不同定位，其至少可分为四个亚家族（见图１）：１２个ＭＡＧＥ—Ａ基因位于Ｘｑ２８，６个ＭＡＧＥ—Ｂ基因位于Ｘｐ２１－２２，３个ＭＡＧＥ—Ｃ基因位于Ｘｑ２６～２７，２个ＭＡＧＥ—Ｄ基因位于Ｘｐｌｌ．２３。最近又新发现ＭＡＧＥ～Ｅ和ＭＡＧＥ－Ｆ亚家族陀。８１。南京｜蔓科大学硕上学位论文ＭＡＧＥ～Ｂ家族基因与ＭＡＧＥ—Ａ基因的同源性较高，故表达规律也较为相似，同样在除生殖系统正常组织中沉默而在恶性肿瘤中表达较多，也能被ＤＡＣ诱导产生，故其在肿瘤组织中的活化也被认为是甲基化的结果¨１０ＭＡＧＥ—ｃ家族是通过ＲＤＡ在肿瘤ｃＤＮＡ库与睾丸特异性序列比对的分析结果中确定的新的一类ＭＡＧＥ基因【４】由于ＭＡＧＥ家族基因之间的同源性较高，所以有关ＭＡＧＥ家族成员关之间的进化关系研究也不少见，主要集中于ＭＡＧＥ—Ａ家族。吴玉章等的研究结果显示ＭＡＧＥ—Ａ家族核苷酸同源性高达５７～９８％，种系发生树显示各成员来源于同一祖先并在不同时间分野，且部分ＣＴＬ表位高度相似，但是ＭＡＧＥ—Ａ家族基因在肿瘤细胞中表达存在异质性１９１。大多ＭＡＧＥ基因有２—３个外显子，其主要的阅读框位于最后一个外显子，编码一段３００氨基酸的蛋白，但ＭＡＧＥ—Ｄ和Ｅ１有所区别，前者有１３个外显子，其开放阅读框位于第２到１２外显子之间，编码一段５７４氨基酸的ＭＡＧＥ－Ｄ蛋白；后者亦有１３个外显子，其开放阅读框位于第１到１３外显子之间‘１０１。由于ＭＡＧＥ－Ｄ南京医科人学硕士学位论文和ＭＡＧＥ—Ｅ１的基因结构及染色体定位高度一致，且与其他ＭＡＧＥ基因诧异很大，故有人把它们视为ＭＡＧＥ基因家族的始祖基因¨¨。ＭＡＧＥ基因编码的蛋白主要分为３个区域，第一个区域的蛋白在除ＭＡＧＥ—Ｏ和ＭＡＧＥ—Ｅ１的ＭＡＧＥ基因家族中各个成员之间同源性都相当高；第二个区域，即核心域亦高度保守，包括ＭＡＧＥ／ＮＥＣＤＩＮ同源序列和一个疏水跨膜区域，可能只在和其他蛋白质的跨膜区域结合才有作用；第三域在ＭＡＧＥ基因家族中也有一定的同源性，但与核心区相比，保守程度相对较低；在ＭＡＧＥ－Ｄ基因蛋白中还有第四域，ＭＡＧＥ—Ｄ３的第四域和ＴＲＯＰＨＩＮＩＮ一致（ＴＲＯＰＩｔＩＮＩＮ被认为是在胚胎着床过程中起作用的一种黏附分子）”１。二、ＭＡＧＥ表达机理１９９４年，ＷｅｂｅｒＪ对ＭＡＧＥ基因的表达机理做了研究，认为ＭＡＧＥ基因的表达与甲基化过程有很密切的关系。他将去甲基化因子ＤＡＣ（５－Ａｚａ一２’一ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）作用于一种不表述ＭＡＧＥ—Ａ１的黑色素瘤细胞系８８８－ｍｅｌ，发现可使细胞表达ＭＡＧＥ—Ａ１基因，在ＤＡＣ撤销后至少１５天内，仍能检测到ＭＡＧＥ－Ａ１的表达，而且这种表达了ＭＡＧＥ—Ａ１的细胞能被ＣＴＬ杀伤，而未用ＤＡＣ处理，不表达ＭＡＧＥ—Ａ１的同样细胞则不能被ＣＴＬ识别破坏¨２１。之后的研究发现，ＤＡＣ可在大肠癌、乳腺癌、Ｔ细胞Ｂ细胞性白血病肿瘤细胞、ＥＢ病毒传染的Ｂ细胞系、甚至正常人Ｔ细胞系中成功诱导出至少一种ＭＡＧＥ基因的表达，少有例外¨３。…。这说明在肿瘤的发生过程中，很可能就有去甲基化因子的参与。一些研究对ＭＡＧＥ的表达机理做了一些深入的探讨，发现ＭＡＧＥ基因的特异性表达并不依赖于组织特异性转录因子，而是由其启动子区域的甲基化和去甲基化机制调控的。ＭＡＧＥ—ＡＩ基因启动子南京医科大学砸上学位论文成分Ｂ和Ｂ７对该基因的表达至关重要，它包含转录基因结合位点，有ＣｐＧ富集区，当ＣｐＧ甲基化时，核蛋白无法结合Ｂ和Ｂ从而阻碍ＭＡＧＥ—Ａ１的表达。故ＤＡＣ的去甲基化作用能稳定的诱导ＭＡＣＥ一１的表达，而ＭＡＣＥ－１又能反过来对上游启动子附近的ＣｐＧ位点进行甲基化，抑制基因的转录，进而抑制了ＭＡＣＥ一１基因的表达，从而，形成了一个负反馈调节。但人体基因表达的调控机制十分复杂，不同基因转录诱发因素亦不同。大多数基因上游ＣｐＧ位点处于非甲基化状态，但未必表达。而ＭＡＧＥ基因在除精原细胞外的所有正常细胞中均处于甲基化状态，故其在正常细胞中不表达，而在睾丸组织中有表达‘１５１０Ｂｅｃｋｅｒ等对正常人伤口愈合早期的皮肤组织进行了研究，发现有ＭＡＣＥ—Ａ１的一过性表达，且表达量和ｐ—ａｃｔｉｎ接近㈠引。由于ＭＡＧＥ在精原细胞和皮肤伤口愈合有早期表达，故可推测ＭＡＧＥ不仅和肿瘤的发生、生长和专转移有关，它在人体正常的细胞分裂、分化和生长过程中也起着非常重要的作用。１９９９年，ＳｏｐｈｉｅＬｕｃａｓ等发现了一种新的ＭＡＧＥ基因，命名为ＭＡＣＥ—Ｄ基因。他们发现，ＭＡＧＥ－Ｄ在来源于四个不同细胞类型的３８个细胞系和肝、肾、脑、心等多种正常组织中检测ＭＡＧＥ—Ｄ的表达，结果ＭＡＧＥ—Ｄ无一例外的表达阳性。如前所述，ＭＡＧＥ—Ｄ的基因蛋白结构和其他ＭＡＣＥ基因大有不同，故其表达机理也有可能与其他ＭＡＣＥ基因有所不同‘１７Ｊ．但迄今为止，仍未有满意的解释见诸报道，其深入机制还有待进一步的研究。三、ＭＡＣＥ基因在不同恶性肿瘤中的表达经ＲＴ—ＰＣＲ检测，除肾细胞癌和髓系白血病外，人体半数以上各种组织来源的肿瘤如７０％的上颌骨癌¨８１，７１％的头颈部鳞南京医科大学钡ｉ学似论文状细胞癌¨川，８４％的食管鳞状细胞癌［２０１，８２％的胃癌川１，６４％的肺癌旧川，８８％的大肠癌幢３１，８６％的肝癌陀引，均至少表达一种ＭＡＧＥ基因，在何杰金病中的ＲＳ细胞也发现ＭＡＧＥ基因的表达。有趣的是，ＬｕｃａＳ等人发现，ＭＡＧＥ－Ｃ１和ＭＡＧＥ－Ａ１的表达有很强的相关性，表达ＭＡＯＥ－Ｃ１的黑色素瘤有９４％也至少表达一种ＭＡＧＥ－Ａ基因…。有人发现，在许多体外培养的肿瘤细胞的ＭＡＧＥ基因的表达率要高于肿瘤标本的ＭＡＧＥ基因的表达率，提示肿瘤细胞的原位培养可能导致ＭＡＧＥ基因的活化幢引。ＭＡＧＥ蛋白在肿瘤中的定位没能完全明了，有的位于胞浆，有的位于胞核，或两者兼有，可能与ＭＡＧＥ蛋白能能穿行于胞浆和胞核，引起混合定位，或是与各种蛋白具有不同功能有关嘶１。有关ＭＡＧＥ基因在恶性肿瘤中的表达研究很多，但仍存在不少分歧。一组对胃癌的研究显示，ＭＡＧＥ的表达与临床病理因素没关系幢¨，而Ｋａｔａｎｏ等却发现ＭＡＧＥ—Ａ１的表达与胃癌浸润深度及分期显著相关，分期越晚，肿瘤浸润越深，ＭＡＧＥ－Ａ１的表达率就越高［２７１，目前的多数国外的研究结果也认同这种相关。这种表达率的差异可能和实验标本的来源人种差异、采用实验方法的敏感性以及实验者的主观性误差都有一定关系。然而国内的研究多认为ＭＡＧＥ基因的表达与·ｆ缶床病理关系无相关性，赵海涛等研究了ＭＡＧＥ—Ａ１０在肝癌中的表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、门脉是否有癌栓、肿瘤包膜是否完整、肿瘤单发或多发、ＨＢＶ及ＨＣＶ感染、ＡＦＰ指标、生存期长短及是否转移复发等临床病理指标是否相关做了统计学分析，研究结果显示ＭＡＧＥ—Ａ１０基因在肝癌中的表达与上述临床病理资料没有统计相关性‘２８１。任秀宝等研究了ＭＡＧＥ—Ａ１、２、３基因在５种消化道系统上皮肿瘤的表达，南京医科大学坝士学位论史统计分析结果显示ＭＡＧＥ基因的表达与患者年龄、性别、临床分期无关陀９１。推测ＭＡＧＥ基因可能是由原癌基因启动的一个静止基因，与细胞分化和增殖无关，也可能与国内外人群差异或样本数差别有关。除ＭＡＧＥ—Ａ基因外，ＭＡＧＥ家族其他亚家族的成员也陆续被发现在恶性肿瘤中有特异性表达。Ｎａｇａｓｈｉｍａ等研究ＭＡＧＥ－Ｂ基因在食管鳞状细胞癌中的表达，发现２４％的细胞系和３６％的临床标本表达至少ＭＡＧＥ－Ｂ１和ＭＡＧＥ－Ｂ２中的一个基因，认为ＭＡＧＥ－Ｂ基因能成为良好的食管癌免疫治疗靶标¨引。国内亦有关于ＭＡＧＥ—Ｂ在恶性肿瘤中的报道，牟东成等研究了ＭＡＧＥ－Ｂ基因在肝癌中的表达，发现ＭＡＧＥ—Ｂ在肝癌中高频率表达且在癌旁组织中不表达，同时发现有相当一部分ＡＦＰ阴性的肝癌患者存在ＭＡＧＥ－Ｂ表达∽１１ＭＡＧＥ－Ｃ基因在恶性肿瘤中表达的报道也不少见，Ｄｈｏｄａｐｋａｒ等研究了ＭＡＧＥ－Ｃｌ在恶性肿瘤的表达，在流式细胞检测中，ＭＡＧＥ—ｃ１在骨髓瘤细胞表面被发现，作者认为它可能成为一种以Ｔ细胞反应为基础的或是抗体介导的骨髓瘤免疫治疗的合适靶标旧引。而ＭＡＧＥ—Ｄ基因则被发现在成年人体正常成熟组织申普遍表达，最近还发现ＭＡＧＥ－Ｄ基因与ｐ７５受体有相互作用，而且可以使神经生长因子依赖性的凋亡ｍ１，也能调节Ｄｌｘ５／Ｍｓｘ家族成员的转录¨钔，所以近来对ＭＡＧＥ－Ｄ基因的功能研究也成为一个热点。当然随着研究的越来越深入，有关ＭＡＧＥ基因的表达也一定会越来越明朗。四、ＭＡＧｌ３基因与肿瘤特异性免疫治疗目前普遍认为机体特异性抗肿瘤的效应细胞主要是ＣＤ８＋细南京医科大学倾十学位论文胞毒性Ｔ细胞。肿瘤细胞的抗原经加工处理成肽段与ＭＨｃＩ类分子结合提呈给ＣＴＬ，ＣＴＬ可通过Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）识别并杀伤肿瘤细胞，引起强烈的ＣＴＬ反应”１。肿瘤抗原还可在抗原提呈细胞内经水解后与ＭＨＣＩＩ类分子结合提呈给ＣＤ４＋辅助Ｔ细胞，调节抗原特异性Ｂ淋巴细胞及ＣＤ８＋Ｔ细胞的功能。直接参与杀伤肿瘤细胞的ＣＤＳ＋ＣＴＬ在体内往往富集在癌细胞集中的组织和部位，构成肿瘤浸润淋巴细胞的主要成分。鉴于ＭＡＧＥ基因的肿瘤特异性表迭及其表达产物能被ＣＴＬ识别的特性，人们逐渐认识到它在肿瘤特异性免疫治疗中的潜在价值。肿瘤特异性免疫的主要局限在于抗原丢失变异体的产生，它使得肿瘤细胞能够逃避由单克隆抗原肽表位诱导的免疫应答。Ｔａｎｚａｒｅｌｌａ等的研究可能有助于解决这一问题，他们发现ＭＡＧＥ家族的４个不同成员ＭＡＧＥ～Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ６基因能共同编码一个限制性的肽表位¨引，诱导特异性ＣＴＬ应答，提示一些貌似杂乱无章的肽表位其实能被多种ＭＡＧＥ基因共享，使肿瘤细胞不容易通过产生抗原丢失变异体而逃避免疫应答。人类恶性肿瘤细胞逃避免疫监视的另一途径是通过ＨＬＡ－Ｉ基因的高甲基化而关闭该基因，不表达相应的ＨＬＡ一类分子，从而使ＭＡＧＥ抗原肽无法递呈给ＣＴＬ，为了解决这一难题，许多学者进行了卓有成效的探索。Ｓｅｒｒｅｎｏ等用ＤＡＣ处理对ＭＡＧＥ—Ａ３肽段免疫治疗无应答的黑色素瘤细胞，使ＨＬＡ－Ｉ基因去甲基化，恢复表达，ＭＡＧＥ分子参与抗原递呈，诱导ＣＴＬ应答”引。迄今为止，人们已找到了多条以ＭＡＧＥ基因抗原为基础的肿瘤免疫治疗途径：①应用树突状细胞（Ｄｃ）疫苗。ＤＣ是最重要的ＡＰＣ，其提呈抗原和启动Ｔ细胞依赖性应答的能力比任何其它ＡＰｃ南京医科大学埘士学位论文都强。Ｄｃ包括能通过ＭＨＣ提呈的为Ｔ细胞所识别的肿瘤多肽表位，还可为效应Ｔ细胞活化提供充足的共刺激信号并能靶向性进入富含Ｔ细胞的淋巴组织中，因此利用Ｄｃ作为疫苗是目前肿瘤生物治疗新的策略。目前用肿瘤抗原肽、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞ＲＮＡ等体外冲击Ｄｃ或将ＭＡＧＥ基因转导到ＤＣ内，均被认为是颇有前途的瘤苗制备方案。临床有报道，应用黑色素细胞冻融物冲击Ｄｃ后回输，部分患者获得显著疗效，并与应用人工合成的肿瘤抗原肽冲击Ｄｃ回输治疗的效果相当。Ａｎｄｅｒｓｅｎ等用ＭＡＯＥ—Ａ３抗原肽孵育单核细胞来源的树突细胞，再将其接种到黑色素瘤患者体内，发现癌症停止进展，患者生存期延长旧¨。这可能与Ｄｃ具有较强的抗原摄取、加工处理能力有关。⑦抗原肽接种途径，即＿：｛奇ＭＡＧＥ抗原肽直接接种到肿瘤患者体内。因为ＣＴＬ识别的是ＭＡＧＥ抗原肽和ＨＬＡ—Ｉ类分子的复合体，所以接受这一治疗的患者应具有相应的ＨＬＡ—Ｉ类分子。人们已在黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部鳞癌及膀胱癌等肿瘤患者身上进行了临床试验，Ｍａｒｅｈａｎｄ等将ＭＡＧＥ抗原肽接种到３９例表达ＭＡＧＥ－Ａ３蛋白和ＨＬＡ～１分子的转移性黑色素瘤患者体内，发现２３例中有７例出现肿瘤缩小，其中３侧完全消失，有２例进入无病状态［３８１。但是作者没有发现明显的ＣＴＬ应答。Ｃｏｕｌｉｅ等研究了这个现象，他们培养从对ＭＡＧＥ—Ａ３肽段免疫治疗发生效应的黑色素瘤惠者血中提取淋巴细胞，用ＭＡＧＥ—Ａ３肽段刺激该培养细胞，发现只有ｉ／４ｏ０００的ＣＴＬ细胞有特异性应答，证实低水平的ＣＴＬ反应同样可以排斥肿瘤１３９１。０基因转染途径，Ｖａｎｐｅｌ等将载有人鼠同源ＭＡＧＥ基因的腺病毒转染小鼠，在小鼠体内发现了明显的ＣＴＬ应答¨引。西抗原递呈细胞途径，即用ＭＡＧＥ抗原肽孵育自体抗原递呈细胞，再南京医科大学硕，ｌ：学位论义将其制成疫苗接种到表达ＭＡＧＥ蛋白的肿瘤细胞内，诱导特异性ＣＴＬ应答。＠黑色素瘤细胞接种途径。Ｒｅｙｎｏｌｄ等将表达ＭＡＧＥ－Ａ３蛋白的黑色素瘤细胞制成多价疫苗，将其注射到ｌ５例已切除黑色素瘤的ＨＬＡ—Ａ２阳性患者皮内，发现９例对该疫苗产生应答者至少有１２个月的无病生存期，而６例未发生免疫应答者则在３—５个月内即出现复发¨¨。［参考文献］［１】ｖａｎｅｎｃｏｄｉｎｇａｌｌｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎＰ，ＴｒａｖｅｒｓａｒｉＣ，ＣｈｏｍｅｚＰ’ｅｔａ１．ＡｇｅｎｅａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙｃｙｔｏｌｙｔｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｏｎａｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４：１６４３，１６４７．［２】ＭｕｓｃａｔｅｌｌｉＦ，ＷａｌｋｅｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａＡＰ，ＤｅＰｌａｅｎＥ，ｅｔａ１．ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｔｈｅＸｐ２１．３ｒｅｇｉｏｎ．ＰｒｏｃＭＡＧＥＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９９５；９２：４９８７～４９９１［３］ＬｕｒｑｕｉｎｔｈｅｈｕｍａｎＣ，ＤｅＳｍｅｔＣ，ＢｒａｓｓｅｕｒＦ＇ｅｔａ１．ＴｗｏｍｅｍｂｅｌｓｏｆｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｌｏｃａｔｅｄｉｎＸｐ２１．３ａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＭＡＧＥ—Ｂｔｕｍｏｒｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｏｒｉｇｉｎｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７；４６：３９７～４０８［４］ＬｕｃａｓｎｅｗＳ，ＤｅＳｍｅｔＣ，ＡｒｄｅｎＫＣ，ｅｔａ１．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａＭＡＧＥｇｅｎｅｗｉｔｈｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９８；５８：７４３～７５２［５］ｌｔｏｈａｎｔｉｇｅｎｓＫ，ＨａｙａｓｈｉＡ，ＮａｋａｏＭ，ｅｔａｌ。ＨｕｍａｎｔｕｍｏｒｒｅｊｅｃｔｉｏｎＭＡＧＥ．ＪＰｌａｅｎＢｉｏｃｈｅｍＴｏｋｙｏ，１９９６；１１９：３８５－－３９０Ｅ，ＡｒｄｅｎＫ，ＴｒａｖｅｒｓａｒｉＣ，ｅｔａｌ。Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，【６］Ｄｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ１２ｇｅｎｅｓｏｆｔｈｅＭＡＧＥｆａｍｉｌｙ．１ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，４０：３６０—３６９．［７］ＫａｗａｎｏＹＳａｓａｋｉＭ，ＮａｋａｈｉｒａＫ，ｅｔａ１．ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＭＡＧＥ—Ｅ１南京医科人学硕士学位论文ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ，２００ｌ；２７７：１２９４１３７［８］ＳｔｏｎｅｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙＢ，ＳｃｈｕｍｍｅｒＭ，ＰａｌｅｙＰＪ，ｅｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅａ１．ＭＡＧＥ—Ｆ１，ａＭＡＧＥｎｏｖｅＪｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｅ，２００１；２６７：１７３～１８２【９］耿淼，吴玉章，等．肿瘤抗原ＭＡＧＥ—Ａ家族成员进化关系的初步研究．中国免疫学杂志，２００２，１８，【１０］ＤｅＢａｃｋｅｒＯ，Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ（５）：３４１—３４４Ｂ，ｅｔａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＡＭ，Ｍａｒｔｉｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｏｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｔｈｒｅｅｍｏｕｓｅｇｅｎｅｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｏｔｈｅｈｕｍａｎＭＡＧＥｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９５，２８（１）：７４—８３．【１１］ＣｈｏｍｅｚＰ，ＤｅｔｈｅＢａｃｋｅｒＯ，ＢｅｒｔｒａｎｄｗｉｔｈｔｈｅＭ，ｅｔａ１．ＡｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｏｆａｌｌｈｕｍａｎＭＡＧＥｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｙ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００１，６１（１４）：５５４４－５１．Ｄ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ［１２］ＷｅｂｅｒＭＡＧＥ一１Ｊ，ＳａｌｇａｅｒＭ，Ｓａｍｉｄｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎｉｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｇａｇｅｎｔ５－ａｚａ一２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９４，５４：１７６６—１７７１ｆ１３］ＦｕｊｉｅＴ，ＭｏｒｉＭ，ＵｅｏＢＡＧＥ３６９—３７２ｇｅｎｅｓｉｎＪａｐａｎｅｓｅＨ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒｓ．ＡｎｎＭＡＧＥａｎｄｂｒｅａｓｔＯｎｃｏｌ，１９９７，８：【１４］ＳｈｉｃｈｉｊｏｇｅｎｅｓＳ，ＹａｍａｄａＡ，ＳａｇａｗａＫ，ｅｔａ１．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｃｅｌｌｓｂｙｔｈｅｏｆＭＡＧＥａｇｅｎｔｉｎｌｙｍｐｈｏｉｄｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ５－ａｚａ－２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ．ＪｐｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９６，８７：７５卜７５６【ｌ５］ＤｅＳｍｅｔＣ，ＬｕｒｑｕｉｎＣ，ＬｅｔｈｅＢ，ｅｔａ１．ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｓｓｉｌｅｎｃｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒａｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｓｅｔｏｆｇｅｒｍｌｉｎｅａｎｄｔｕｍｏｒ．ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓＭｔｈａＣｐＧ－６ｃｈｐｒｏｍｏｔｅｒ．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，】９９９，１９（１１）：７３２７－７３３５．［１６］ＢｅｃｋｅｒＪＣ，ＧｉｌｌｉｔｚｅｒＲ，ＢｒｏｃｋｅｒＥＢ，ｅｔａ１．Ａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ—ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅ（ＭＡＧＥ）ｆａｍｉｌｙｉｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ——塑至堕型查兰堡±堂垡堡塞ｈｍｎａｎｓｋｉｎｄｕｒｉｎｇｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｌ１９９４，５８：３４６—３４８．［１７】ＬｕｃａｓＳ，ＢｒａｓｓｅｕｒＦ，ＢｏｏｎＴ＿ＡｎｅｗＭＡＧＥｇｅｎｅｗｉｔｈｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｏｅｓｎｏｔｃｏｄｅｆｏｒｋｎｏｗｎＭＡＧＥａｎｔｉｇｅｎｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＴｃｅｌｌｓ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９９，５９（１６）：４１００．３．［１８］ＥｕｒａＭ，ＣｈｉｋａｍａｔｓｕＭＡＧＥ一１，－２１５：５５—５９．Ｋ，ＯｇｉＫ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓａｎｄ一３ｂｙｈｕｍａｎｍａｘｉｌｌａｒｙｃｅｌｌｓ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９５，［１９］ＥｕｒａＭ，ＣｈｉｋａｍａｔｓｕｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｈｕｍａｎＫ，ＯｇｉＫ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＧＥｓｑｕａｍｏｕｓ—ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｉｎｔｈｅａｄ－ａｎｄ—ｎｅｃｋＪＣａｎｃｅｌ１９９５，６４：３０４—３０８．［２０］ＱｕｉｌｌｉｅｎＶ，Ｒａｏｕｌ几，ＨｅｒｅｓｂａｃｈＤ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＧＥｇｅｎｅｓｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓ—ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９７，１７：３８７—３９１．【２１１ＨＪ，ＹａｎｇＹ，ＦｕｊｉｅＴ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＭＡＧＥｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｈｕｍａｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９７，１７：３５５９——３５６３［２２】ＹｏｓｈｉｍａｔｓｕＴ’ＹｏｓｈｉｎｏＩ，ＯｈｇａｍｉＡ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ—ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｉｎｈｕｍａｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ．ＪＳｕｒｇＯｎｃｏｌ，１９９８，６７：１２６—１２９【２３］ＨａｓｅｇａｗａＨ，ＭｏｒｉＭ，ＨａｒａｇｕｃｈｉＭ，ｅｔｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ、ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＡｒｃｈＰａｔｈｏｌＬａｂＭｅｄ．１９９８．１２２：５５１—５５４．Ｎ，ｅｔａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ［２４】ＴａｈａｒａＫ，ＭｏｒｉＭ，ＳａｄａｎａｇａＭＡＧＥｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｇ１９９９，１５；８５：１２３４—１２４０．［２５］ＧｉｌｌｅｓｐｉｅＡＭ，ＣｏｌｅｍａｎａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒＲＥ。ＴｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｍｅｌａｎｏｍａＴｒｅａｔＲｅｖ，１９９９，ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ２５（４）：２１９—２２７．南京医科大学倾＋学位论文［２６］ＫａｒｉｎＯｈｍａｎＦｏｒｓｌｕｎｄ，ＫａｔａｒｉｎａＮｏｒｄｑｖｉｓｔ，Ｔｈｅｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｇｅｎｅｓ—Ａｎｙｃｌｕｅｓｔｏｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ？ＪＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ，２００１，２６５（２）：１８５－１９４［２７］ＫａｔａｎｏＭ，ＮａｋａｎｕｒａＭ，ＭｏｒｉｓａｋｉＴ，ｅｔａ１．Ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ·－ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅ－－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｉｎｖａｓｉｖｅｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｔａｇｅｏｆｄｉｓｅａｓｅ．ＪＳｕｒｇＯｎｃｏ，１９９７，６４：１９５—２０１［２８１赵海涛，芮静安，赵屹等．ＭＡＧＥ一１ｏ基因在肝细胞肝癌中的表达及Ｉ晦床意义．中国微创外科杂志２００２，２（６）：４１９—４２１［２９Ｊ任秀宝，邵莹，徐琪等．ＭＡＧＥ在５种上皮性肿瘤中的表达特点．中国肿瘤临床２００１，２８（１０）：７４３—７４５【３０］ＮａｇａｓｈｉｍａＨ，ＳａｄａｎａｇａＮ，ＭａｓｈｉｎｏＫ，ｅｔａ１．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭＡＧＥ—Ｂｇｅｎｅｓｉｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＪｐｎＪＣａｎｃｅｒＲｅｓ．２００１，９２（２）：１６７—７３．［３１】牟东成，冷希圣，彭吉润等．黑色素瘤抗原ＭＡＧＥ—Ｂ亚家族基因在肝细胞癌中的表达．中华肿瘤杂志，２００４，２６（１）：４０—４２．［３２】ＤｈｏｄａｐｋａｒＭｖ，ＯｓｍａｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫ，Ｔｅｒｕｙａ—Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ，ｅｔａ１．ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ（ＣＴ）ａｎｔｉｇｅｎｓＭＡＧＥ—Ａ１，ＭＡＧＥ－Ａ３，ｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔｇａｍｍｏｐａｔｈｉｅｓｉｓｒｉｓｋｓｔａｔｕｓｏｆＭＡＧＥ—Ａ４，ＣＴ－７，ａｎｄＮＹ－ＥＳＯ－１ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｓｉｔｅ，ｓｔａｇｅｍａｄｄｉｓｅａｓｅ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎ．２００３２３；３：９．［３３］ＳａｌｅｈｉＭＡＧＥＡ．Ｈ，ＲｏｕｘＲｐ，ＫｕｂｕＣ．Ｊ，ｅｔａ１．ＮＲＡＧＥ，ａｎｏｖｅｌｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｔｈｅｐ７５ｎｅｕｏｔｒｏｐｈｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｄｎｅｒｖｅｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｎ，２０００，２７：２７９．２８８［３４］ＭａｓｕｄａＹ＇ＳａｓａｋｉＡ，ＳｈｉｂｕｙａＨ，ｅｔａ１．Ｄｌｘｉｎ—ｌ，ａｎｏｖｅｌｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｂｉｎｄｓＤｌｘ５ａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｓｉｔｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉ０１．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：５３３ｌ一５３３８．Ｅ７