绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化

・组织工程・

绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化

胡运生1　马保安1　李文海2　张勇1　范清宇1

　　【摘　要】　　目的　利用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记技术,观察组织工程骨在体内形成过

TM程中种子细胞的变化与转归。　方法　Adeno2X2GFP扩增和纯化后,测定病毒滴度,感染新西兰大白兔骨髓间充质干

细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),倒置相差显微镜观察细胞形态变化,并在荧光显微镜下观察GFP表达情况。确认标记成功后,将其与未标记的兔MSCs共同成骨诱导培养3周后,接种于磷酸钙骨水泥(calciumphosphatecement,

CPC)2纤维蛋白胶(fibringlue,FG)复合支架材料,构建组织工程骨作为实验组,回植于供体兔皮下。单纯CPC2FG复合

支架材料植入对称部位作为对照。术后1、2、3周行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性测定;4周,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察和󰂪型胶原、骨钙素(osteocalcin,OC)免疫组织化学检测成骨细胞功能蛋白,Masson染色观察新骨形成。　结果　Adeno2XTM2GFP经扩增和纯化后,病毒噬菌斑形成,测得病毒滴度为3×108pfu󰃗ml。Adeno2XTM2

2、3周,实验组ALP活性GFP感染MSCs后96h,可见GFP表达,感染率达50%～70%,细胞分裂增殖基本正常。术后1、

分别为12.546±1.091、16.567±0.659和20.443±0.706,对照组分别为0.453±01113、01243±01018和01308±01056,差异有统计学意义(P<0105)。4周,实验组大体可见组织工程新骨形成,对照组未见新骨形成;组织学显示实验组新生骨小梁围绕材料孔隙形成,CPC2FG复合支架材料部分降解;实验组󰂪型胶原、OC免疫组织化学结果阳性,对照组未见阳性染色;实验组可见新生组织内有GFP标记的细胞。　结论　组织工程骨组织结构与松质骨小梁类似,新生组织表达

GFP,提示组织工程骨组织的形成来源于接种的细胞。

【关键词】　　组织工程骨　　骨髓间充质干细胞　　腺病毒载体　　绿色荧光蛋白　　兔中图分类号:R318108　Q813111　　文献标识码:A

GREENFLUORESCENTPROTEINLABELINGGENETRANSFERREDINTOMESENCHYMALSTEMCELLSTOTRACETHEIRDIFFERENTIATIONINVIVO󰃗HUYunsheng,MABaoan,LIWenhai,etal.CenterofOrthopedicSurgery,OrthopedicOncologyInstituteofPLA,TangduHospitalofFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’anShaanxi,710038,P.R.China.E2mail:huys111@hotmail.com

Correspondingauthor:FANQingyu,E2mail:bonetm@fmmu.edu.cn

【Abstract】　　Objective　Toobservethetissueengineeredbonefabricatedwiththeculturedmesenchymalstemcells(MSCs)bythegreenfluorescentprotein(GFP)genetransfer.Methods　TherecombinantAdeno2XTM2GFP

expressionvectorwaspurifiedafterbeingpackedandproliferatedbytheHEK293cells,andthenitwasusedtoinfecttherabbit’sMSCsdirectlyafterthevirustiterwasassayed.Thecellmorphologicalchangeswereobservedundertheinvertedphasecontrastmicroscope,andtheexpressionofGFPwasobservedunderthefluorescencemicroscopeto.TheGPF2labeledMSCsandthepureMSCswereculturedtogetherintheconfirmsuccessofthelabelingofMSCs

conventionalosteogenicsupplementsfor3weeks,andthentheywereseededontothecompoundscaffoldofthecalciumphosphatecement(CPC)andthefibringlue(FG)toformanewkindofthetissueengineeredbone.Itwasimplantedintothedonatorrabbitsubcutaneouslytobeusedastheexperimentalgroup;incontrast,thepurecompoundscaffoldof.Thealklinephosphatase(ALP)activitytheCPC2FGwithoutanyMSCswasimplantedinthesamerabbitasacontrolassaywasperformedrespectivelyat1,2and3weeksafteroperation.GFPwasobservedunderthelaserconfocalmicroscopeat4weeksafteroperation,andtheformednewbonewasharvestedat4weeksandevaluatedbytheMassonstaining,theimmunohistochemistrystainingofosteocalcin(OC)andcollagentype󰂪.Results　Thevirustiterwas3×108pfu󰃗mlafterproliferationandpurification.ExpresstionofGFPwasconfirmed96hafterMSCswereinfectedbytheAdeno2XTM2GFPexpressionvectorandtheinfectionratewasproximally50%270%.IncontrasttoMSCs,divisionandproliferationoftheGPF2labeledMSCswerenotsignificantlydifferent.基金项目:国家自然科学基金资助项目(30330610)

作者单位:1第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心(西安,710038),2胸外科通讯作者:范清宇,教授,博士导师,研究方向:骨肿瘤的综合治疗,E2mail:bonetm@fmmu.edu.cn

TheALPactivityintheexperimentalgroup

・634・.21,No.6ChineseJournalofReparativeandReconstructiveSurgery,June2007,Vol

(121546±11091,161567±01659,201443±01706)wassignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup(01453±01113,01243±01018,01308±01056),respectivelyat1,2and3weeksafteroperation(P<0105).Thetissue.Therewerenewly2formedtrabeculaearoundtheporeofthecompoundscaffold,andengineeredboneformedat4weeks

theimmunohistochemistrystainingofOCandcollagentype󰂪werepositive.ThelaserconfocalmicroscoperevealedthattheGFP2labeledcellsexistedinmanynewly2formedtissues,andthecompoundscaffoldofCPC2FGwaspartlydegraded.Conclusion　TheengineeredboneissimilartothespongyboneandthecomposedcellsoriginatefromtheculturedMSCs,allofwhichcanbeconfirmedbytheGFPgenetransfertechnique.

【Keywords】　　Tissueengineeredbone　　Mesenchymalstemcells　　Recombinantadenovirusvector　　

Greenfluorescentprotein　　Rabbit

Foundationitem:NationalNaturalScienceFoundationofChina(30330610)

　　骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,

MSCs)因获取及培养容易,扩增后数量充足,且自体细胞避免了免疫排斥反应等特点,已成为骨组织工程研究中理想的种子细胞[1,2]。MSCs在体外成骨诱导培养条件下,能表现出一些成骨细胞的表型特征,即碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、󰂪型胶原、骨钙素(osteocalcin,OC)表达及钙结节形成等,在体内复合生物材料植入骨缺损部位一定时间后能成骨[325]。但对于其植入受体后如何转归,是在体内各种因子的刺激下向成骨方向转化,最终形成新骨;还是在受体组织中死亡,而由受体组织中的成骨细胞或干细胞沿材料爬行替代成骨;或是二者兼有这个问题还存在争论。一般认为,种子细胞在体内各种因子的刺激下向成骨方向转化,最终参与形成新骨,但是缺乏证据。我们的实验利用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因标记技术,直接追踪植入的MSCs在体内的分化与转归,为阐明MSCs在体内异位成骨的作用,提供了直接证据,也为组织工程种子细胞的标记提供了一种灵敏、可靠且又直观的方法。1　材料与方法1.1　实验动物及材料

1.1.1　实验动物　取1月龄新西兰大白兔2只,雌雄

国);抗坏血酸、地塞米松(Sigma公司,Β甘油磷酸钠、

美国);超级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);󰂪型胶原、免疫组织化学试剂盒OC单克隆抗体、

(武汉博士德生物工程公司);ALP检测试剂盒(南京建成生物制品有限公司);CPC(上海瑞邦生物材料有限公司);FG(广州倍绣生物技术有限公司);细胞培养瓶和培养板(Costar公司,美国)。1.2　实验方法

TM

1.2.1　Adeno2X2GFP重组腺病毒表达载体的扩增TM和纯化　将Adeno2X2GFP感染HEK293细胞,完全出现细胞病变效应(cytopathogeniceffect,CPE)后,收集溶菌产物和细胞,反复冻融3次,14000×g离心

10min后取上清收获病毒。氯化铯密度梯度离心法纯

化,病毒噬菌斑形成,测定病毒滴度,-80℃保存备用。1.2.2　兔MSCs的分离培养　于实验兔股骨大粗隆,无菌抽取骨髓2～3ml,置于肝素化的离心管内,用由

10%胎牛血清、100U󰃗DMEM、ml青霉素和100U󰃗ml链霉素组成的基础培养基洗涤细胞,以100×g离心

5min。细胞沉淀重悬于基础培养基,接种于75cm2的培养瓶中,置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。3d后更换培养液,去掉非贴壁细胞,以后每3～4天换液1次。2～3周生长融合成单层成纤维样细胞,一般7～10d可传代。细胞长满后用0.25%胰酶消化传

2

代,以1×104󰃗cm密度接种于培养瓶中,倒置相差显微镜下观察。将接近长满的MSCs按上述方法连续传代,传至第3代细胞时备用。

TM

1.2.3　Adeno2X2GFP重组腺病毒感染标记兔

不限,体重1.0±0.2kg,由第四军医大学实验动物中

心提供。

1.1.2　腺病毒载体及支架材料　携带GFP的腺病毒

TM

载体(Adeno2X2GFP)由我科鱼兵博士馈赠,为E1、E3区缺失的5型重组腺病毒载体;人胚肾细胞株(HEK293细胞)由我科裘秀春博士馈赠;磷酸钙骨水泥(calciumphosphatecement,CPC)2纤维蛋白胶(fibringlue,FG)复合支架材料按FG∶CPC为1ml∶5g的比例与纯CPC支架材料分别制成直径4.73mm、

MSCs　取第3代兔MSCs,待细胞长至60%～70%融

合时,更换2%胎牛血清的培养液,过夜。在其培养液中

TM

加入感染复数为100的Adeno2X2GFP重组腺病毒,换10%胎牛血清的正常培养液继续培养48h。1.2.4　MSCs接种及体内回植　GFP标记兔MSCs体外继续扩增并用成骨诱导体系(含10%胎牛血清、50

-8mg󰃗L抗坏血酸,10mmol󰃗LΒ甘油磷酸钠,1×10

～30d,2～3d换液,并与等mol󰃗L地塞米松)培养20

高2.00mm的圆柱状[6],直接分装于24孔培养板,塑

料包装袋热压密封,60Co消毒备用。

1.1.3　主要试剂　DMEM培养基(Gibco公司,美

中国修复重建外科杂志2007年6月第21卷第6期・635・

量未标记兔MSCs同时进行扩增和成骨诱导。成骨诱导的两种MSCs混匀接种至CPC2FG复合支架材料上,按Vacanti等[7]推荐标准:接种细胞数量5×107个󰃗ml,计算出实验使用的1枚支架体积约需用1.8×10个细胞。24孔培养板中继续成骨诱导培养1

6

±标准差表示,组间比较采用Dunnett、t检验,P值<0105为有统计学意义。2　结果

TM

2.1　Adeno2X2GFP重组腺病毒的扩增和纯化

周后,取4枚支架回植于实验兔一侧背部竖脊肌中,以4枚单纯CPC2FG植入对称部位作为对照组并分别标

记。

1.3　检测指标

1.3.1　Masson染色观察　1只兔分别于术后1、2、4周取出标本,将其从中间一分为二。标本用10%中性福尔马林固定,常规脱钙、脱水、透明、石蜡包埋,5Λm连续切片,Masson染色后光镜下观察。

1.3.2　ALP活性检测　另1只兔于术后1、2、3周取材,清除标本表面肌肉,称重,置入5ml塑料管,加入生理盐水2ml,机械匀浆,24000×g离心1h取上清用分光光度计法测单位组织质量的ALP活性。所有检测至少做3次。

1.3.3　OC的表达　术后4周标本切片二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,室温滴加3%过氧化氢30min0105%胰酶消化30min,PBS缓冲液振洗3次,室温10%羊血清30min,滴加OC一抗(鼠抗兔OC单克隆

2GFP感染HEK293细胞,8d出现

CPE。HEK293细胞感染后出现贴壁不牢,易脱落,部分细胞空泡样变及死亡(图1)。经空斑形成实验测得病

Adeno2X

TM

毒滴度为3×108pfu󰃗ml。2.2　MSCs分离培养及GFP标记

兔MSCs表现为长梭形的成纤维细胞样,排列呈

TM

旋涡状(图2)。Adeno2X2GFP感染后细胞形态规则,生长旺盛,随培养时间延长多角形细胞增多,未见显著细胞形态改变,部分细胞胞浆可见较多分泌性颗粒,细胞分裂增殖基本正常,与未感染的MSCs相比,三角

TM

形、多角形细胞所占比例增多(图3)。Adeno2X2GFP感染兔MSCs,48h后可在荧光显微镜蓝光激发波长下,见到较暗的绿色荧光,腺病毒感染成功;96h后部分细胞发出明亮的绿色荧光,感染率达到50%～70%(图4)。2.3　MSCs在异位成骨中的作用

2.3.1　Masson染色观察　术后第2周,各组植入区可见少量炎性细胞浸润,周围肌肉组织基本正常。实验组和对照组中FG己大部分吸收,可见MSCs增殖、聚集,CPC被由MSCs分化而来的软骨样细胞和软骨样组织分割包绕。对照组见较多团块状残余材料,以CPC为主,FG部分吸收,无软骨细胞形成。术后第4周,实验组软骨细胞和软骨组织逐渐成熟,新骨形成,残余材料内FG己完全吸收,CPC被进一步分割、降解,呈现空泡化,其内部有细胞长入(图5a)。对照组仍有较多团块状材料残留,其周围见纤维组织增生,未见新骨形成(图5b)。

2.3.2　ALP活性检测　实验组各时间点单位组织质量的ALP活性高于对照组,且差异有统计学意义(P<0105),见表1。

2.3.3　OC和󰂪型胶原的表达　实验组免疫组织化

抗体)4℃过夜,取出后37℃滴加二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)30min,PBS缓冲液振洗3次,DAB显色5～10min,水洗后苏木素细胞核衬染,检测OC的表达。

1.3.4　󰂪型胶原检测　术后4周标本以40g󰃗L多聚

甲醛固定,置复合脱钙液24h,水洗,脱水,石蜡包埋,制成4Λm连续切片,采用SABC法行󰂪型胶原免疫组织化学染色。

1.3.5　GFP检测　2只兔术后4周取材标本,一部分

做冰冻切片,直接于激光共聚焦显微镜下观察GFP的表达。

1.4　统计学方法

采用SPSS11.0统计软件包进行分析。数据以均数

.1　TheALPactivityofthespeciTabmenatdifferenttimes(n=3,U󰃗g,θx±s)

表1　各组各时间点的ALP活性(n=3,U󰃗g,θx±s)

分组

Group1周

1week12.546±1.09130.453±0.113　

2周2weeks16.567±0.65930.243±0.018　

3周3weeks20.443±0.70630.308±0.056　

实验组

Experimentalgroup

对照组

Controlgroup

　　3与对照组比较P值<0.05

　　3Comparedwiththecontrolgroup,P<0.05

・636・.21,No.6ChineseJournalofReparativeandReconstructiveSurgery,June2007,Vol

学染色可见细胞中出现棕黄色着色,为阳性染色(图6、

7)。对照组未见阳性染色。

2.3.4　GFP检测　术后4周,激光共聚焦显微镜示组织中的细胞仍能高效表达GFP(图8)。3　讨论

细胞在体内的转归。

CPC主要成分为羟基磷灰石,与骨基质中的无机成分类似,具有良好的生物相容性。实验证明CPC植入骨缺损处后充当新骨形成的支架,发挥着骨传导的作用,内部细胞长入形成新骨与未降解材料互相交织,融为一体[8]。但单纯CPC与细胞亲和性差,降解慢,机械强度也有限,故将CPC和FG制成复合支架材料,利用FG强大的黏合和止血功能,弥补CPC黏结性差、抗水性能不足的缺点。同时,FG强大的黏结作用,还能增强CPC的机械强度。另外,利用FG降解快的特性,以逐步提高复合支架材料的孔隙率,加速新骨长入[6]。但是,对于该复合支架材料而言,在应用组织工程技术构建组织工程骨的过程中,若无适当的种子细

在骨组织工程中最终形成新生骨组织的细胞来源,存在一定争议。一种观点认为是外源性种子细胞分化而来,另一种认为是自体相关细胞分化而来。只有将植入的种子细胞与原有的自身细胞区分开来,才能进一步探讨植入种子细胞的真正作用。我们的实验尝试通过外源标记基因导入种子细胞,对其在体内转化进行追踪,以明确早期新生骨组织的细胞来源,探讨种子

图1　Adeno-XTM-GFP感染HEK293细胞后出现CPE(倒置相差显微镜×200)　图2　兔MSCs表现为长梭形的成纤维细胞样,排列呈旋涡状(倒置相差显微镜×200)　图3　Adeno-XTM-GFP感染后细胞生长旺盛,多角形细胞增多(倒置相差显微镜×200)　图4　Adeno-XTM-GFP感染MSCs96h

a　实验组　○b　对照组　图6　术后4周,实验组OC免疫组织化学后GFP的表达(荧光显微镜×100)　图5　术后4周Masson染色观察(×100)　○

染色阳性(×200)　图7　术后4周,实验组󰂪型胶原免疫组织化学染色阳性(×200)　图8　术后4周,新生骨组织中的细胞高效表达GFP(激光共聚焦显微镜×100)

Fig.1　AppearanceofCPEaftertheHEK293cellswereinfectedwithAdeno-XTM-GFP(Invertedphasecontrastmicroscope×200)　Fig.2　Therabbit’sMSCsshowingthefibroblast-likespindledmorphologyandtheirarrayinawhirlpoolpattern(Invertedphasecontrastmicroscope×200)　Fig.3　Therabbit’sMSCsproliferatingquicklyandthecellswithacuboidal,stellateappearanceincreasingafterthecellswereinfectedbyAdeno-M

-XTM-GFP(Invertedphasecontrastmicroscope×200)　Fig.4　TheGFPexpressiondetected96hoursafterMSCswereinfectedwithAdeno-XT

a　TheexperiGFP(Fluorescencemicroscope×100)　Fig.5　TheMassonstainingobservationat4weeksafteroperation(×100)　○mentalgroup　b　Thecontrolgroup　Fig.6　Thei○mmunohistochemistrystainingofOCpositiveintheexperimentalgroupat4weeksafteroperation(×200)　Fig.7　Theimmunohistochemistrystainingofcollagentype󰂪waspositiveintheexperimentalgroupat4weeksafteroperation(×200)　Fig.8　Thehighly-expressedGFPinthenewly-formedbonetissuesat4weeksafteroperation(Laserconfocalmicroscope×100)

中国修复重建外科杂志2007年6月第21卷第6期・637・

胞标记方法,将对最终的效果评估造成一定困难。成熟的GFP蛋白较为稳定,将GFP基因通过腺病毒载体转染入MSCs后,GFP可在MSCs内稳定表达,虽然表达时间较短(4～6周),但对于一般骨愈合新生骨组织形成过程而言(骨痂形成期),足以示踪种子细胞的分化。此载体系统及表达的GFP对靶细胞无明显的毒害作用[9,10],故为骨组织工程种子细胞标记提供了一种灵敏、可靠而直观的方法。

　　实验选用新西兰大白兔竖脊肌肌袋异位成骨环境,尽可能避免了周围成骨细胞的长入;将制备的组织工程骨回植入细胞供体兔的肌袋内,可以排除免疫因素的影响,评估组织工程骨的异位成骨能力。因为供体兔的肌袋内环境仅能为组织工程骨提供营养支持或肌源性的MSCs,无任何诱导成骨因素,植入组织工程骨的结果将取决于原有组织工程骨的生物学特性。我们的实验对兔MSCs加以GFP标记,以明确种子细胞在体内成骨的作用。结果发现4周后,对照组无新骨形成,实验组组织ALP活性较对照组高(P<0.05),组织切片OC及󰂪型胶原免疫组织化学染色阳性,表明有成骨细胞活动并分泌OC及󰂪型胶原,植入的MSCs已成功地分化为成骨细胞,并分泌基质,逐步钙化,转化为骨细胞,成为新生骨组织的主要细胞来源;组织切片Masson染色提示有骨小梁样新骨形成,且激光共聚焦显微镜下细胞显示绿色荧光,表明是由植入的MSCs转化而来的成骨细胞和骨细胞,提示种子细胞在早期组织工程骨中起着重要作用。

　　我们的实验初步建立了一套完整的细胞标记技术,为组织工程技术修复体内骨缺损机制的研究,提供了有效工具。但由于腺病毒载体表达标记基因时间短且骨组织后期钙盐沉积的特性,给荧光检测带来了困难,从而难以进行更长期的观察。正常骨缺损修复在新生骨组织形成后,在生理应力的刺激下,会不断地改建塑形,最终形成正常的骨组织结构和外形,自体骨移植

的最终长期结果亦是被周围骨组织完全替代。尽管实验表明种子细胞在体内转化为成骨细胞和骨细胞,并且参与新骨形成,但组织工程骨在体内长期转归如何,特别是种子细胞的长期转归如何,是个令人更感兴趣的问题,这就需要在该实验的基础上,继续探索出一种更有效的骨组织工程种子细胞的标记方法。

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(收稿:2006207217　　修回:2006212204)

(本文编辑:王雁　董奇男)

・致读者・

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本刊编辑部

2007205220