肝郁脾虚证模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质的变化

肝郁脾虚证模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质的变化1

李艳彦，谢鸣，陈禹，王洪海

北京中医药大学国家重点学科方剂学学科 (100029，北京)

E-mail：liyy1002@163.com摘 要：目的：探讨复合造模法复制肝郁脾虚证大鼠模型的HPA轴变化及特点。方法：大鼠采用慢性束缚＋过度疲劳＋饮食失节法，连续三周，自然恢复一周。观察造模期间各不同时间点大鼠肾上腺重量及指数、下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)及皮质酮(CORT)的变化。结果：与正常组比较，模型大鼠肾上腺重量第一周显著增加(P<0.001)，第三、四周显著减低(P<0.001和P<0.01)，其肾上腺指数在实验各周均显著高于正常组(P<0.05和P<0.01)；下丘脑CRH第三周显著低于正常组(P<0.05），第四周回升并显著高于正常组(P<0.05)；血浆ACTH在第一、三、四周均显著降低(P<0.05)；血浆CORT第一周显著降低(P<0.05)，第二周有所回复，第三、四周仍显著降低(P<0.05和P<0.001)。结论：该肝郁脾虚证大鼠模型存在HPA轴的功能减低，垂体对上位激素调节的反应能力减低可能是该模型的一个重要的生物学特征。

关键词：肝郁脾虚证；动物模型；大鼠；HPA轴；复合造模法

根据中医病因发病学原理，作者在参考目前肝郁证模型的慢性束缚应激法[1]和脾虚证模型的过度劳累加饥饱失常法[2,3]的基础上，探索用慢性束缚应激＋过度疲劳＋饮食失节的复合方法成功复制出类肝郁脾虚证的大鼠模型。本文研究了该模型复制中HPA轴（下丘脑-垂体-肾上腺皮质）的变化及其特点。

1材料

1.1动物：健康雄性Wistar大鼠，体重220±10g，级别SPF/VAF，动物许可证号为SCXK(京)2002-0003，由北京维通利华实验动物中心提供。所有动物提前一周购入，5只／笼。光照节律12L∶12D(6:00～18:00)，室温19±2℃，保持安静。 1.2造模用束缚筒：自制束缚筒为有机玻璃制成的圆筒状结构，主筒长25厘米，筒口外经7厘米，内径5厘米；前端置有一直径小于主筒的、可以前后调节的带有透气孔、便于大鼠头伸进的有机玻璃前罩，后端为可调的开关闸门。

1.3试剂：CRH-RIA试剂盒由解放军总医院东亚放免研究所提供；ACTH-RIA试剂盒、CORT-RIA试剂盒由北京海科锐生物技术中心提供。

1.4主要仪器：低温离心机(DDL—5型)，上海安亭科学仪器厂产；SN—695B型智能放免γ测量仪，上海核所日环光电仪器有限公司产。

2 方法

2.1 制模方法

采用慢性束缚应激＋过度疲劳＋饮食失节的方法。实验前全部动物进行预游泳，剔除游泳时间少于10分钟、大于20分钟的大鼠。

1

本课题为国家211项目基金资助课题。

通讯作者：谢鸣，医学博士，北京中医药大学国家重点学科教授， E-mail：xieming603@263.net。

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造模：合格造模大鼠于每天上午8：00置于束缚盒中限制3小时，下午2：00置于盛有温水(22±1℃)的大塑料桶中游泳10分钟。隔日喂食(隔日禁食，隔日足量给食)，连续3周。自然恢复阶段：于造模第22天开始，停止上述造模因素，自然饲养条件下观察。

2.2 分组处理

大鼠随机分为正常组和肝郁脾虚模型组(以下简称模型组)，每组40只。模型组动物按上述制模方法给予处理，正常组动物不加任何刺激，自然饲养。于造模的第一、二、三、四周的前一天下午8点，分别从两组中随机抽取大鼠10只，禁食，第二天大鼠断头取血4ml置于加入0.3M EDTA·2Na 40μl和抑肽酶40μl抗凝剂的试管中，4℃，3000rpm 15min，取血浆，待测ACTH、CORT；分离下丘脑，称重后置于煮沸的生理盐水(1ml)中继续煮沸3min，再加1N的冰醋酸0.5ml于匀浆器中匀浆提取，再用1N NaOH 0.5ml中和，3000rpm 30min，取上清液贮存于－20℃以下待测CRH。打开腹腔小心剥离肾上腺，用滤纸吸去肾上腺上附带血液，用电子天平称重。

2.3 指标观测

体重、肾上腺重量及肾上腺指数（组织重量/体重）：称量记录； 下丘脑CRH、血浆ACTH、CORT：放免法，按试剂盒说明操作。 2.4 数据统计学处理

所得数据均以x±S表示，用SPSS 11.5软件统计处理。先采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行检验，后经多组间比较，采用Student-Newman-Keuls检验。

3 结果

3.1 不同造模时间大鼠体重的变化

结果见图1。从图1中可以看出，正常组大鼠体重随着观察时间的延长而不断增加，模型组大鼠体重在造模期间无明显变化，自然恢复第四周显著增加。与正常对照组比较，模型组大鼠体重实验观察的四个时间点均显著降低(P＜0.001)。

350体重（g）300250★★★200★★★★★★★★★1500w1w2wnorm ★★★

3wgypx4w

P＜0．001，compared with the relevant normal group(n=10).

图1 不同造模时间大鼠体重的变化

3.2不同造模时间大鼠肾上腺重量及指数的变化

结果见图2。从图2-1中可以看出，正常对照组大鼠肾上腺重量在第二、三周显著增加，第四周趋于平稳。与正常对照组比较，模型组大鼠肾上腺重量在造模第

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一周即见显著升高(P＜0.001)，第二周与正常组接近(P>0.05)，第三、四周显著低于正常组(P＜0.001和P＜0.01)。从图2-2中可以看出，正常对照组和模型组大鼠的肾上腺指数均在第二周升高，第三、四周恢复。与正常对照组比较，模型组大鼠肾上腺指数在实验期间各观察点均显著升高(P＜0.01和P＜0.05)。

0.3肾上腺指数(g/g)0.065adrenal gland(g)0.0550.0450.0350.0250.0151w2wnorm3w4wgypx★★★★★★★★0.250.20.150.10.051w★★★★★2wnorm3w4wGYPX

图2-1 二组大鼠肾上腺重量的变化 图2-2二组大鼠肾上腺指数的变化

P＜0．05，P＜0．01，each group)；

★

★★

★★★

P＜0．001，compared with the relevant normal group(n=10，

图2 不同造模时间大鼠肾上腺、肾上腺指数的变化

3.3 不同造模时间大鼠下丘脑CRH、血浆ACTH、CORT的变化

结果见图3。从图3-1中可以看出，正常对照组大鼠下丘脑CRH实验期间变化不大；模型组大鼠下丘脑CRH第三周显著降低(P＜0.05)，第四周回升并显著高于正常组(P＜0.05)。从图3-2中可以看出，正常对照组大鼠血浆ACTH前三周没有变化，第四周有所升高；模型组大鼠血浆ACTH变化趋势同正常组，但一、三、四周显著低于正常组(P＜0.05)。从图3-3中可以看出，正常对照组血浆CORT于第二周下降，第三周回升，第四周继续升高；模型组大鼠血浆CORT在实验各周变化不大，但第一、三、四周显著低于正常组(P＜0.05和P＜0.001)。

500CRH(ng/ml)★250ACTH(pg/ml)40030020010001w2wnorm3w4wgypx★2001501005001w2wnorm3w4wgypx★★★

图3-1 二组大鼠下丘脑CRH的变化 图3-2 二组大鼠血浆ACTH的变化

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403530CORT(ng/ml)25201510501w2wnorm3wgypx4w★★★★★

图3-3 二组大鼠血浆CORT的变化

★★★★P＜0．05，P＜0．001，compared with the relevant normal group(n=10，each group)；

图3 不同造模时间大鼠HPA轴的变化

4讨论

我们曾根据中医发病学理论，运用复合因素造模法(慢性束缚应激＋过度疲劳＋饮食失节)复制出肝郁脾虚证大鼠模型。不少研究表明，肝郁脾虚证可能涉及到包括现代消化、神经、内分泌、免疫等多系统功能的异常[4]。为进一步了解该肝郁脾虚证大鼠模型的生物学特点，本文对模型复制中的大鼠HPA轴的变化进行了观察。

在正常生理状态下，肾上腺分泌的GC对下丘脑-垂体-肾上腺轴有负反馈抑制作用，但在慢性应激条件下，作为应激反应引爆激素的下丘脑CRH分泌过多，过量的CRH进一步导致垂体ACTH的分泌增多，最终造成GC分泌过多，过量的GC使HPA轴的负反馈机制失调，导致下丘脑CRH、垂体ACTH、肾上腺GC持续升高，表现为HPA轴功能持续亢进[5]。引起机体出现抑郁症、学习和记忆障碍、应激性精神紊乱、免疫力低下等等多系统的功能紊乱。本实验采用束缚加饮食失节和运动疲劳的复合方法处理大鼠三周，发现复制三周的模型大鼠肾上腺重量显著减轻，下丘脑CRH、血浆ACTH、CORT均显著低于正常组，提示该法复制的的肝郁脾虚证模型大鼠的HPA轴呈功能减低状态。这一结果不仅与通常单一束缚法复制肝郁模型所观察到的

也与利用不可预知的多种应激随机组合方法建立的肝血浆ACTH明显增加[6-8]不同，

郁模型大鼠血浆ACTH显著升高[9]等结果表现出的HPA轴的呈功能亢进状态不同。结果也提示不同的应激因子引起的应激效应不同，且有复合应激因子共同作用的效应机制可能比较复杂。

下丘脑、腺垂体、肾上腺皮质三者形成一个自动调节系统，血中GC浓度的变化可对下丘脑分泌的CRH和腺垂体分泌的ACTH具有负反馈调节作用，当血中GC和垂体ACTH浓度降低时，下丘脑分泌CRH抑制作用解除而合成与分泌加强。本实验中观察到停止造模一周内，模型大鼠的上述指标均有一定程度的恢复，其中下丘脑CRH显著高于对照组，可能是对下丘脑对血浆ACTH、CORT降低的反馈性反应的结果；但此时的血浆ACTH、CORT仍明显低于对照组，反映了模型大鼠HPA轴中的垂体和肾上腺皮质对下丘脑CRH反应的迟滞，提示该模型中存在HPA轴调节功能的异常，垂体对上位激素调节的反应能力减低可能是该模型的一个重要的生物学特

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征。已知免疫因子参与HPA轴的功能调节，如IL－1、IL－6、TNF均能激活或诱导下丘脑-垂体-肾上腺合成和释放CRH、ACTH、CORT[10]。我们曾观察到该模型组血清IL－1、IL－6、TNF含量均较对照组降低（另文发表），推测该模型中存在内分泌-免疫的整体低下状态，而有关免疫因子的降低与HPA轴的功能降低密切相关。

值得提出的是，本实验中的模型大鼠肾上腺指数第一至第四周均高于对照组，这似与赵歆[11]等曾观察到的慢性束缚应激大鼠的肾上腺指数显著增加的结果一致，但本实验中大鼠的肾上腺重量在造模第一周增加，第三、四周显著降低，这显然与观察期间的模型组大鼠体重停止增加而正常组大鼠持续增长有关。进一步结合垂体ACTH和血浆CORT的变化情况，提示模型复制中大鼠肾上腺皮质功能先亢进后又转入抑制；结果还提示非正常生长条件下的肾上腺指数变化的意义可能不及其重量变化。

综上，采用慢性束缚＋过度疲劳＋饮食失节法复制肝郁脾虚证模型，连续造模三周，模型大鼠体重、肾上腺重量及指数、下丘脑CRH、血浆ACTH、CORT发生显著变化，自然恢复一周后上述指标未见明显恢复。结果表明，该肝郁脾虚证模型大鼠存在HPA轴功能的降低及调节功能的紊乱。

参考文献

[1] 熊振芳,朱清静. 柴胡疏肝散对慢性束缚应激性肝郁证大鼠的影响[Ｊ].中国中西医结合消化杂志,2004,12(4):220

[2] 朱清静,罗欣拉,熊振芳. 柴胡疏肝散对慢性束缚应激性肝郁证大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节作用[Ｊ].湖北中医杂志,2003,25(11):7

[3] 周永生,樊雅莉,陈小野等. 观察脾气虚证动物模型规范化的初步研究――部分免疫功能方面[Ｊ].实验动物科学与管理,2003,20(2):1

[4] 罗国钧,罗海琳. 慢性肝病肝郁脾虚证的研究进展[Ｊ].山西中医,2001,17(3):57 [5] 王子梅. ACTH激素分泌调节新进展[Ｊ].国外医学内分泌学分册,1994,14(4):171

[6] Zachariasen RD. Phenylethanolamino-N-methyl transference acting in the avian adrenal following immoblization or adreeno-corticotropin[Ｊ]. Endocrino1,1974,23:193

[7] Bousquet WF,Miya TS. Modification of stress response in hista-mine depleted rats[Ｊ]. Brain. Res.J. Pharmacol,1996,27:177

[8] Kwenqusky,Mikulazl.Adrenal and urinary catecholamine in rats during adaptation to repeated immoblization stress[Ｊ]. Endo-crinol,1970,87:738

[9] 金光亮,南睿,郭霞珍. 慢性应激肝郁证大鼠模型的建立[Ｊ].北京中医药大学学报,2003,26(2):18 [10] 路翠艳,潘芳. 应激反应中HPA轴的中枢调控和免疫调节[Ｊ].中国行为医学科学,2003,12(3):353 [11] 赵歆,陈家旭,杨建新,等. 疏肝中药复方对慢性束缚应激大鼠下丘脑－垂体－肾上腺轴的调节[Ｊ].实验动物科学与管理,2003,20(2):6

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The Change of Rats'Hypothalamus-pituitary-adrenal axis of the TCM’s syndrome model of GYPX（stagnation of liver-qi

and deficiency of spleen-qi）

Li Yanyan，Xie Ming，Chen Yu，Wang Hongmei

Beijing University of Chinese Medicine （100029）

Abstract

Objective：To study the change of Hypothalamus-pituitary-adrenal axis(HPAA) in the TCM’s syndrome model of GYPX（stagnation of liver-qi and deficiency of spleen-qi）made by a new compound method. Methods:Adopting chronic astricting、excess fatigue and out of constant diet on rats for constant three weeks and stopping doing on them in the 4th week. Observing the changes of the weight and index of rats’ adrenal gland and the content of Corticotropin-releasing Hormone(CRH) in hypothalamus, Adrenocorticotropic Hormone(ACTH) and Corticotrophin(CORT) in plasma. Results：Compared with relevant normal group,the weight of the model rats’ adrenal gland increased significantly in the 1st week(P<0.001) and decreased in the 3rd and 4th week(P<0.001和P<0.01), but the index of adrenal gland increased significantly during the 4 weeks(P<0.05和P<0.01); CRH in hypothalamus decreased significantly in the 3rd week(P<0.05),and brought back and increased significantly in 4th week(P<0.05); ACTH in plasma decreased significantly in the 2nd, 3rd and 4th week(P<0.05); CORT in plasma decreased significant in the 1st week(P<0.05), went back a little in 2nd week and decreased again in 3rd and 4th week(P<0.05和P<0.001). Conclusion: The depressed function of HPAA of the rats’ GYPX model is observed. The lower reactive ability of pituitary to the ajust of superior hormone may be the important biologic character of this model.

Keywords: syndrome of liver-qi stagnation and spleen-qi deficiency ; animal model ; rats ; HPAA ; a compound method of establishing model

作者简介：李艳彦，女，北京中医药大学2003级在读博士，研究方向：方证相关物质基础的研究。

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