猪苓菌培养特性研究进展

猪苓菌培养特性研究进展

作者：张长青 章松柏 鲁红学

来源：《现代农业科技》2009年第20期

摘要阐述了猪苓菌的形态结构、适生条件、营养特性、培养基配方、适生树种及猪苓菌与伴生菌、蜜环菌的相互关系和诱导猪苓菌丝扭结形成菌核的相关因子,以期为猪苓菌的深入研究和人工栽培提供参考。

关键词猪苓菌;培养特性;伴生菌;蜜环菌;菌核形成

中图分类号S646.2文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)20-0105-03

猪苓菌(Dendropolyporus umbellatus(Pers.)Jülich),别名猪苓花、猪灵芝,于实体丛生,肉质鲜美,其地下的菌核即为猪苓,是传统的真菌药物之一,在我国已有2 000多年的药用历史。现代医学证明,猪苓具有消炎、利尿、渗湿、通淋、退肿、降压、轻身耐老、抗癌、抗辐射等功能,临床上可治尿路结石、黄疸、急性肾炎、暑热水泻、全身水肿、心源性水肿、腹泻、尿急、尿频、尿道痛、肝硬化、腹水、乙型肝炎。猪苓多糖制剂对肺癌、肝癌、食道癌、宫颈癌及白血病均有较好的临床效果。随着我国医疗事业的发展,以猪苓为原料的成品药必将得到进一步开发,探索人工栽培的新途径必然会倍受关注。该文就猪苓菌的培养特性进行了阐述,以期为猪苓菌的深入研究及人工栽培提供有价值的参考。

1菌丝的培养特性

1.1菌落与菌丝形态结构

猪苓菌的分离一般可采用子实体、菌核组织分离和孢子分离。PDA、CPDA或GYA(葡萄糖-酵母粉-琼脂粉)可作为分离或母种培养基[1-3]。在PDA上,猪苓菌落呈圆形,菌丝白色,絮状,气生菌丝发达。在平板或斜面培养基上均具有较强的爬壁能力。猪苓菌色素的形成受培养基中添加的成分(如单双糖、糖醇及酪氨酸)、温度、pH值和光照等因素的影响。

猪苓菌丝细胞狭长,多分枝,细胞壁较薄,直径在0.95～4.50μm[2,4]之间,生殖菌丝上锁状联合突起结构明显,顶端有膨大。平行菌丝间常有长短不一的H型横向菌丝融合桥,进而形成菌丝网

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络。众多菌丝纠结或合并可形成直径10.0μm以上的菌索或大小为14.0～16.0μm×12.0～15.0μm的拟菌核结构。培养过程中气生菌丝可断裂形成节孢子或顶端单生或2～3个并生,椭球形,大小为3.0～16.0 μm×2.5～6.5 μm的厚垣孢子。显微观察,在猪苓菌丝间散布有形状规则、晶形完整的八面体或双锥形草酸钙结晶。用高碘酸-Schiff试剂染色老化菌丝,在老化菌丝胞壁上或老化菌丝断裂处富积有大量能被染成淡红色、圆粒状的次生代谢多糖结晶[5]。 1.2温度、光照和pH值对猪苓菌生长的影响

猪苓菌丝在5～35℃[6-8]范围内均可生长,当温度低于15～18℃时,菌丝生长速度减慢,长势一般,菌丝褐变缓慢或暂无褐变。当温度高于28～30℃时,菌丝生长速度也出现减慢,长势变差,并易出现老化变褐[9,10]。在5℃以下或35℃以上,菌丝生长几乎停滞。猪苓菌丝生长的适宜温度为24±4℃,最适温度为25℃[4,8]。

在黑暗和光照条件下,猪苓菌丝均可生长。但在全黑暗下菌丝生长快、长势好;全光照或12h光暗交替,菌丝生长较慢,且易出现褐变老化[6,8]。

有试验表明,每天给猪苓菌丝2～3h的4℃低温处理,有利于诱导其菌核的产生。一定温差(10℃)的变温处理和暗培养,可诱导猪苓菌丝直接分化子实体原基[6,8]。

一般而言,多数真菌都适宜在偏酸性环境中生长[11]。猪苓菌丝可以在pH值为3.5～9.0的环境下生长[4,8],但以中性偏酸(pH值4.0～7.0)的条件比较适合,pH值低于4.0或高于8.0的菌丝生长慢、长势差,易出现菌丝褐化[6-8,10]。 1.3菌丝生长的营养特性

1.3.1对碳源的利用。猪苓菌对碳源有较为宽泛的适应性。葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽糖醇、低聚异麦芽糖、甘露糖、甘露醇、低聚甘露糖、木糖、木糖醇、低聚木糖、淀粉、糊精、甘油、山梨醇、乙醇、羧甲基纤维素等都可以作为猪苓菌丝生长的碳源。其中麦芽糖、甘油、山梨醇、麦芽糖醇、低聚异麦芽糖作碳源菌丝生长速度快,气生菌丝发达,菌丝丛疏;淀粉、乙醇、半乳糖、木糖、木糖醇、低聚木糖作碳源菌丝生长速度虽然较慢,但气生菌丝极发达,菌丝丛厚,尤其是木糖醇和木糖为碳源时,气生菌丝最发达,菌丝丛最厚。葡萄糖、蔗糖、甘露糖、糊精、甘露醇、低聚甘露糖等作碳源菌丝生长速度较快,气生菌丝发达,但老化快;果糖作碳源菌丝生长速度较快,气生菌丝易组织化呈肉皮状[10,11];猪苓菌对羧甲基纤维素的利用率较低[12]。

1.3.2对氮源的利用。有机氮源(动物性、植物性和微生物性)比无机氮源更适合猪苓菌菌丝生长。在有机氮源中,猪苓菌丝生长速率和长势依次为:酵母膏>黄豆粉>玉米糠>蛋白胨>麸皮粉[13];在无机氮源中,猪苓菌丝生长速率和长势依次为:硝酸钠>硫酸铵>尿素[10]。猪苓菌在含尿素的培养基上,虽然径向生长缓慢,但尿素能在一定的使用浓度范围内随浓度的升高较早地促使

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菌丝扭结形成幼小的白色拟核,并渐变成类似于猪苓菌核表面有油漆光泽的灰黑色拟核。菌丝拟核化的立体生长自然会影响菌落的平面径向生长[14]。

碳氮比对猪苓菌丝生长速度有明显的影响,但对菌丝长势影响不明显。猪苓菌丝在碳氮比10～100∶1的范围内均可生长,但适宜的碳氮比为40～70∶1之间,最佳碳氮比为50∶1[13]。 1.3.3无机盐对猪苓菌生长的影响。无机盐是猪苓菌生命活动中不可缺少的营养物质,它们不仅具有调节渗透压、氢离子浓度、氧化还原点位的作用,还是菌体的结构、酶或辅酶的组成成分,有维持酶活的功能。无机盐的使用因培养菌种类、培养基质类型及培养方式的不同,使用剂量、作用效果也会不同,需灵活掌握。如硝酸钠(NaNO3)、柠檬酸三铵[(NH4)3C6H5O7]、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵[(NH4)2SO4],按0.1%的添加量分别加入GPC(葡萄糖蛋白胨玉米浆)培养基中,硝酸钠对猪苓菌丝生长有明显促生作用,磷酸氢二钾和硫酸铵、硫酸镁作用效果不明显,柠檬酸三铵和硫酸镁对猪苓菌丝生长不利[10]。磷酸二氢钠(NaH2PO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)分别添加到相应PDA培养基中,各无机盐菌对猪苓菌丝生长有利,尤以P、Cu、Zn的促生作用更为明显。各无机盐的适宜添加量分别为:NaH2PO4 0.090g/L、K2SO4 2.000g/L、CuSO4·5H2O 0.012～0.024g/L、ZnSO4·7H2O 0.024～0.030 g/L[14]。

1.3.4其他添加物对猪苓菌生长的影响。在培养基中适量添加非生物物质和生物类培养液,如活性白土、硅藻土、高岭土、猪苓伴生菌水提取物、蜜环菌水提取物、假单胞杆菌(Pseudomonas alba Migula)发酵液、灵芝[Ganoderma lucidum(Legss.ex Fr.)Karst]发酵液及金针菇[Flammulina velutipes(Fr.)Sing] 发酵液等均有良好的促生作用[10,15]。

2培养基配方对猪苓菌丝生长的影响

不论野生猪苓,还是保存的猪苓菌株的菌丝生长对营养的需求都比较简单,可以在多种复杂或简单的半合成或合成培养基上生长。如PDA培养基、CPDA培养基、葡萄糖-硝酸钠-硫酸铵、黄豆饼粉培养基、玉米粉培养基、胡萝卜培养基、苹果培养基、麦芽汁培养基、GMY(葡萄糖-麦芽膏-酵母膏)培养基、GPC(葡萄糖-蛋白胨-玉米浆)培养基、GPY(葡萄糖-蛋白胨-酵母膏)培养基、甘油-蛋白胨-玉米浆培养基、米糠(麦麸)培养基、麦粒培养基、木屑密环菌(或猪苓菌核或榛蘑)煮汁培养基、羧甲基纤维素培养基或只有碳源和氮源的简单培养基[1,9,10,12]。其中黄豆饼粉培养基、玉米粉培养基、苹果培养基、CPDA培养基、GPY培养基、GPC培养基和麦芽汁培养基比较适合菌丝生长,而PDA培养基、GMY培养基、麦粒培养基、麦麸培养基、胡萝卜培养基、木屑密环菌、猪苓菌核或榛蘑煮汁等培养基次之[1],葡萄糖-硝酸钠-硫酸

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铵、羧甲基纤维素培养基较差[1,10]。但猪苓菌在初始接种菌丝生长较差的培养基上,经过1～2次转接后可逐渐适应培养基质,菌丝生长速度会有所提高[1]。

麦芽汁培养以及以甘油(2.5%～7.5%)、甘露醇(2.5%～15%)[16]为碳源的培养基,不仅容易诱导猪苓菌丝形成拟核,同时,还利于菌丝体产生猪苓酮类生物活性物质[10]。

猪苓菌丝的液体培养可分为静态浅层培养、振荡培养和通气培养。适宜于静态浅层培养的配方为:麦芽汁液体培养基[17]、葡萄糖+马铃薯煮汁+蜜环菌煮汁培养基(pH值5.0)、麦芽糖+蜜环菌煮汁+麦麸煮汁培养基(pH值5.0)[18]、鲜苹果250g、蛋白胨5g、麦芽糖15g、磷酸二氢钾0.75g、硫酸镁0.75g、V■ 75mg培养基(pH值3.9)[19]。适宜于振荡培养的配方为:玉米面液体培养基[18]、玉米粉30g、酵母膏30g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 1.0g、CaCO3 1.0 g、V■ 0.lg培养基(pH值5.8)[20]。适宜于通气培养的配方为:可溶性淀粉20g、豆饼粉提取液300mL、玉米浆20mL、硫胺素0.5g(pH值6.5)[17]。液体培养以进入稳定期(培养第13～18d)菌丝体多糖含量最高。

3猪苓菌在不同树种段材上的生长

Choi Kyoung-dal等将猪苓菌丝体分别接种在经过灭菌的16种树木段材(直径15cm,长30cm)上,置于塑料袋中,在20℃黑暗条件下,培养10周后观察,结果猪苓菌丝能在16种树的段材上生长。其中野茉莉(Styrax japonica)、柿树(Diospyros kaki)、阔叶红松(Pinus koraiensis)、朝鲜紫茎(Ste-wartia koreana)、日本桤木(Alnus japonica)、灯台树(Cornus con-troversa)、Populus alba×tomentiglandulosa、鸡爪槭(Acer palmatum)、樱花(Prunus serrulata)和刺槐(Robinia pseudo-acacia)上菌丝相对生长旺盛,菌丝浓密。在野茉莉、朝鲜紫茎、灯台树、Populus alba× tomentiglandulosa、鸡爪槭上还可形成菌核[4]。

4猪苓菌与蜜环菌、伴生菌的关系

1955年川村清一在猪苓菌核上首次观察到有蜜环菌索存在[21],21世纪初郭顺星等从野生猪苓穴中分离到了一株猪苓菌伴生菌[22]。至此人们开始了猪苓菌与蜜环菌和伴生菌相互关系的探究[23]。

4.1猪苓菌、伴生菌单独培养

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尽管猪苓菌与伴生菌在同种或不同培养基上单独培养时,二者菌落的外部形态差异较大。但二者的菌丝形态比较接近,且菌丝提取物在247nm处的化学指纹图谱相似。对猪苓菌与伴生菌的5.8SrDNA及其两侧的ITS1区和ITS2区序列分析表明,伴生菌的ITS序列全长628bp,而猪苓菌的ITS全长序列均为626bp,相似性达99.36%[24],可见伴生菌与猪苓在分子进化上有着极高的亲缘性,伴生菌是多孔菌属中的一个种(polyporus sp.)。 4.2猪苓菌与蜜环菌共培养

猪苓菌与蜜环菌共培养时,两菌接触面无拮抗线出现,当蜜环菌菌索侵入猪苓菌落时(约深入猪苓菌落0.5cm处),很快就遭到猪苓菌强烈的阻遏反应,形成封锁菌索延伸的隔离腔,并反侵染于蜜环菌菌索的皮层细胞及侵染带边缘细胞,导致环菌菌索内部中空化[25]。蜜环菌则以消化腔内猪苓菌丝获取营养,当隔离腔中猪苓菌丝被消化消耗殆尽时,由于蜜环菌无法产生新生菌索而突破隔离腔,因此不能获得新的营养补给而出现生活力减弱,最终在隔离腔中溶解反而成为猪苓菌的营养。隔离腔和反侵入机构则成为猪苓菌从蜜环菌中获取营养的通道,使猪苓菌核得以发育[26]。猪苓菌与蜜环菌的关系是一种寄生与反寄生的共生营养关系。 4.3猪苓菌与伴生菌共培养

猪苓菌在单独培养时很少有菌丝束的分化。当猪苓菌与伴生菌共培养时,在两菌充分接触界面处先形成一个菌丝交融带,继后形成结构致密、拱形隆起、红褐色的拮抗线。拮抗线中央为一些不具生活力的死细胞,靠近拮抗线的猪苓菌丝细胞膨大而中空,细胞壁单侧加厚。而靠近拮抗线的伴生菌菌丝细胞也中空,但细胞壁不增厚或略有增厚。拮抗线隆起的顶层细胞逐渐分化成表皮老化后脱落。随着伴生菌色素的分泌,培养基逐步变褐,猪苓菌落表面菌丝分化产生大量菌丝束,从菌丝束交织的地方分化出菌核原基。伴生菌是猪苓菌丝分化形成菌核的重要生物调控因子[27-29]。

4.4蜜环菌与伴生菌共培养

蜜环菌与伴生菌共培养时,伴生菌长势远不如单独培养时健壮。在蜜环菌影响下,菌落直径仅至1cm左右便停止生长,伴随菌落颜色变暗、表面干燥,最终完全凋亡。蜜环菌能穿透整个伴生菌菌落,在伴生菌菌落下方产生大量细小分枝。蜜环菌与伴生菌的关系也是一种寄生与反寄生的共生营养关系。显微结构观察提供了有力的佐证:侵入到伴生菌菌落内的蜜环菌菌索成近中空状,只残存少量不具生活力的髓部菌丝。在蜜环菌的皮层上,也明显存有伴生菌侵入蜜环菌皮层细胞的侵入点,并使皮层细胞由外向内瓦解[30]。尽管如此,由于伴生菌长势较弱,竞争不过蜜环菌,最终逃脱不了凋亡的厄运。但从另一个角度反映出伴生菌对蜜环菌有促使漆状物分泌、保持蜜环菌生长旺盛并不断产生新菌索和分枝的良好作用,比猪苓菌更适合蜜环菌寄生。 4.5猪苓菌、伴生菌和蜜环菌共培养

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猪苓菌、伴生菌和蜜环菌三者共同培养,猪苓对蜜环菌的防御能力有所下降,表现为蜜环菌侵入猪苓菌落更深入(侵入菌落1.5cm),猪苓菌丝也不能形成完整的防御区。猪苓菌与伴生菌之间只形成一个菌丝交融区,不再形成拮抗线。由于猪苓菌的存在,使得伴生菌对蜜环菌的耐受力有所提高,即使蜜环菌产生的新分枝均向伴生菌一侧生长,但伴生菌依然保持活力。猪苓菌和伴生菌均能在蜜环菌菌索皮层上形成侵入位点[30],建立寄生关系,获得各自所需营养。

猪苓菌与伴生菌、蜜环菌构成了一个既相互关联又相互制约的营养循环体系。伴生菌是猪苓菌核形成关键所在,而蜜环菌与菌核形成的关系不大,只是在猪苓菌核形成后才侵染菌核,是猪苓菌核继续生长发育的关键。野生状态下,蜜环菌一般不侵入当年新生白苓,只能侵染越冬后的灰苓和黑苓。

另外,有报道指出,以猪苓菌丝体接种在灭菌的木段上,在无伴生菌或蜜环菌的情况下依然可以形成菌核[4];陈德育等[8]用棉皮木屑混合培养基(pH值自然),在25℃下培养,菌丝长至菌袋的1/3时,置于室温(20～22℃)、空气相对湿度80%的条件下,3周后室内自然光照处理下可形成菌核组织,完全黑暗处理能在袋口较快地形成菌核。刘瑛颖等[16]对用GPC培养基所诱导的菌核进行了分析,其形态学和化学指标成分与野生菌核相似。可见,诱导猪苓菌核形成的因子较多,伴生菌也绝非是唯一的关键因子。因此,对猪苓菌核的形成机理仍需进行深入系统的探究。

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