产品说明：该酶催化契合的双链DNA或RNA的5'-磷酸末端和3'-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口(1)。
--------------------------------------------------------------------------------来源： 源于E.coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 (2)。应用：
限制性酶切片段的克隆 (3)。
将linker或adapters 连接到DNA片段的平滑末端。反应缓冲液： 1X T4 DNA Ligase Buffer:
[50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 µg/mlBSA, (pH 7.5 @ 25°C)]。推荐DNA浓度(0.1 - 1 µM 的5′末端)。使用注意：ATP是反应必须的辅因子。这一点与要求NAD作辅因子的大肠杆菌DNA连接酶不同。
如在反应体系中补加1 mM的ATP，连接反应还可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液(NEBuffers)或在T4 DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。
质量保证： 无核酸内、外切酶污染。每批T4 DNA连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出待连接DNA末端的任何破坏。结果表明>99.9%的DNA末端未受任何降解。
单位定义(粘性末端活性单位）：在20µl连接反应体系、0.12µM(300µg/ml)的5'-末端浓度条件下，16°C反应30分钟，能使50% Hind Ⅲ消化的λDNA片段连接所需的酶量定义为一个NEB单位。一个粘端连接活性单位=0.015个韦氏（ATP-PP交换）单位(4)。
的经
一个韦氏单位=67个粘端连接活性单位。
浓度：400,000 units/ml和2,000,000 units/ml。
贮存条件： 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%的甘油，-20°C贮存。热失活条件: 65°C 加热10分钟。
室温连接反应：为方便起见，连接反应可以在室温（20-25°C）条件下进行。粘性末端连接：在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA连接酶，反应10分钟。平滑末端连接：在20µl反应体系中加入1µl T4 DNA 连接酶反应2小时，或者加入1µl高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。
另外，NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V [15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。
图1：在25°C条件下，用1 unit（1:400稀释后取1 µl）T4 DNA连接酶连接λDNA/Hind Ⅲ片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图2：在20 µl反?µ逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。
图2：在20 µl反?µ逑抵校?貌煌?康腡4 λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。
DNA连接酶连接平滑末端的
二、常见问题及解答
Q1：有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败?A1：
反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。
反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。
去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。
DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。
连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。
插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。
加入过多的连接混合物至感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。
插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。
连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。
连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。 电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB# M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？A2：
感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。
细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。 大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB＃E8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。
连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。
插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。
重组子太大（>10,000 bp）不能进行化学转化：用电转化。
Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败？A3：
内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。
内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。
内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。
DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不
佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。
Q4：使用T4 DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNA。A4：注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。
转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。
转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1％。
酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤1相近。
酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1的1％。
Q5：什么情况下选用T4 DNA连接酶？
A5：T4 DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要过夜。如果需要热失活连接酶，选用用T4 DNA连接酶。高浓度T4 DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构。
Q6：T4 DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？
A6：可以，高浓度T4 DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。
Q7：T4 DNA连接酶连接应该加多少DNA？
A7：单位定义用的是0.12 μM (300 μg/ml) lambda HindIII。高浓度的DNA用于linker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平。载体＋片段总浓度应为：1-10 μg/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。
Q8：T4 DNA连接酶可在其它NEBuffers中使用吗？
A8：连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer
中进行，但需要加终浓度为1mM ATP。确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。当使用NEBuffer 3时，如果DNA中盐浓度较高可导致连接效率下降。
Q9：T4 DNA连接酶可以热失活吗？
A9：可以，65 °C孵育20分钟可以失活。如果buffer【快速连接试剂盒（NEB# M2200）内的buffer】中含有PEG则不可热失活，否则会抑制转化。
Q10：Weiss单位（韦氏单位）与NEB粘性末端单位如何换算？
A10：一个NEB粘性末端单位等于0.015 Weiss单位，即一个Weiss单位等于67个NEB粘性末端单位。
二、关于NEB M2200 T4 DNA 快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答
1、产品特性介绍以及使用方法
产品说明：本试剂盒可在室温(25°C)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。应用：
DNA片段克隆入载体文库构建TA克隆Linker连接
线性DNA的再环化快速连接试剂盒的优点：
快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成方便-可在室温条件下进行连接反应灵活-适合于各种常规连接反应试剂盒成分：
Quick T4 DNA 连接酶(重组酶)
2X Quick Ligation Buffer
贮存条件 (连接酶)：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mMEDTA, 1 mM DTT, 200 µg/ml BSA和50%甘油。
2XQuick Ligation Buffer：132 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mMATP，15%Polyethylene glycol(PEG 6000)*， pH 7.6@25°C。* 美国专利号：4,582,802。
注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。快速连接步骤:
混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10µl。
加入10 µl 2×Quick Ligation Buffer，混匀。加入1 µl Quick T4 DNA连接酶，彻底混匀。稍事离心，室温 (25°C) 作用5分钟。冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。
不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。
转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法：
冰上融化感受态细胞。
在1.5 ml微量离心管中，将约5 ng (2 µl)的连接混合物冷却。
在DNA样品中加入50 µl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。冰上放置30分钟。
37°C热休克2分钟，冰上冷却5分钟。
加入950 µl室温培养基，37°C温育1小时。取100 µl样品铺在适宜的培养基上。37°C培养过夜。
注意事项： 用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25°C 5分钟达到反应终点, 超过这个时间效果并不会更好。事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25°C反应过夜，则转化效率会降至75%。待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。要获得最适连接，在加2× Quick LigationBuffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10 µl。DNA片段体积大于10 µl的，则相应增加2× Quick Ligation Buffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。
为保证有效连接， 总的载体DNA+插入片段的浓度应当在1-10 µg之间。对单插入来说，插入片段:载体比例在2-6之间最好, 低于2:1就会导
致低的连接效率, 高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的比例做几个连接反应。
电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低PEG浓度。我们推荐使用柱离心式DNA纯化方法。
连接进程曲线：LITMUS28载体(NEB #N3628)经EcoRⅤ切割(平滑末端)或Hind Ⅲ切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自ΦX174 DNA的Hae Ⅲ消化产物(平滑末端)或λDNA的Hind Ⅲ消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB-amp平板上37°C生长过夜。
限制性酶切片段的克隆 (3)。
2、快速连接试剂盒常见问题及解答
Q1: 在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化？A1:可能的原因有：
快速连接反应被热失活了。快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。
快速连接混合液在电击之前没有纯化。快速连接缓冲液中含有的PEG会阻止电击反应。可以应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。
过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过30min，也不会获得更好的效果。
反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应。可以纯化一下DNA。脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP）没有完全失活或去除。
可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶
（NEB#M0289）。因为热敏磷酸酶在65℃ 5min即可完全失活而无需纯化DNA。
另外一些影响因素：
缓冲液超过一年，其中的ATP已经降解。补加新鲜的ATP至终浓度为1mM。
DNA浓度过高，连接产物只有线性分子。建议总DNA浓度在1-10 μg/ml之间。
插入片段和载体没有磷酸基团。
感受态细胞中加入的连接反应混合物过多。建议用量： 50μl 感受态细胞中加入1-5μl混合物。
插入片段长度超过10 kb，反应条件无法满足环化要求。可以降低插入片段浓度。
限制性内切酶切割不完全。当用于PCR产物末端的切割时，建议在两端的酶切位点上加至少6个保护碱基。
限制性内切酶没有完全热失活。如果选用的内切酶不能被热失活可以用酚/乙醇纯化DNA。
内切酶消化过程中存在星活性，造成载体或插入片段的非特异性切割。可以通过凝胶电泳检测。如果出现一些多余的条带，应减少酶切过程中的酶用量或缩短反应时间。
Q2: 为什么转化会失败，可以进行哪些对照实验？
A2: a. 细胞已死或者并不是感受态。如果必要重新更换细胞，进行下述对照实验（i-iv）。
重组蛋白在E.coli中不兼容。可以利用pMAL系统（NEB#E8000S）将其与麦芽糖结合蛋白进行融合表达。另外也可以换成E.coli之外的表达系统。
连接后的DNA中含有纵列的倒置重复序列，E.coli无法识别。如果可以，去除重复序列。或换成E.coli之外的表达系统。
注意：每一个对照实验应选用相同的DNA浓度，通常每个转化的用量为0.1-1ng.
用没有切割的载体检测细胞活性以及质粒的抗性。在有抗性和没有抗性的平板上进行检测。
切割后的载体不要进行连接：以检测未切割的载体。可以利用胶纯化来去除残余的0.1%的未切割的载体。
将质粒（无插入片段）切割后进行再连接以检测连接活性以及DNA末端的完整性。对于没有切割过的质粒，应该有60-70%可以再连接.
切割，脱磷，然后连接质粒用于检测由于不完全脱磷引起的背景。对于
没有切割的质粒应该<3%.
Q3: 快速连接试剂盒中提供的T4 DNA连接酶的浓度是多少？
A3: 2,000,000units/ml. 与NEB高浓度T4 DNA连接酶（NEB#M0202）相同。
Q4: 普通的T4 DNA 连接酶可以用快速连接缓冲液吗？
A4：当用于普通T4 DNA连接酶时，应将反应时间延长至15分钟。但是建议孵育时间不要超过30分钟。
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容