总蛋白检查法(欧洲药典)

1 目的 Purpose

建立《欧洲药典》总蛋白检查法的检验通则，为总蛋白的检验、方法的开发和建立提供参考依据。 2 范围 Scope

适用于产品按《欧洲药典》总蛋白检查法进行总蛋白的检测。 3 职责Responsibility

3.1 QC人员：负责本检验通则的起草。 3.2 质检部经理：负责本检验通则的审核。 3.3 质量负责人：负责批准本检验通则。 4 定义Definition NA 5 内容 Procedure 5.1 测定原理

5.1.1 本试验采用Lowry法测定蛋白含量。

5.1.1.1 Lowry法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物，

此复合物使福林-酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下福林-酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。 5.1.1.2 在一定范围内蓝色的深浅与蛋白质浓度呈正比，在750nm处有最大吸收，测定溶液在此

波长的吸收度，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，测定供试品中蛋白质的含量。 5.1.2 福林-酚试剂主要与蛋白质中的酪氨酸残基作用，室温放置20～30min颜色达到最深，然后颜

色逐渐变浅。故本法采用加入福林-酚试剂后放置30min测定。 5.2 干扰因素

5.2.1 此方法对干扰物质敏感，可采取对供试品进行蛋白质沉淀的方法去除干扰。大部分干扰物质可

使溶液颜色略变浅，洗涤剂可使溶液颜色加深，高盐度可使其形成沉淀。不同蛋白质可形成不同响应强度的颜色，故参考物质和测试蛋白必须相同。 5.2.2 对待测样品进行蛋白质干扰物质的分离是很有必要的，按如下所述对测试溶液进行干扰物质的

分离，干扰物质通过稀释达到最小浓度，且此浓度能保证蛋白的测量精确度。 5.3 操作步骤 5.3.1 试药试液

5.3.1.1 使用超纯水制备此方法中使用的缓冲液和试液。

5.3.1.2 硫酸铜试液：取硫酸酮100mg，酒石酸钠200mg，加水溶解并稀释至50mL，混匀；另

取碳酸钠10g，加水溶解并稀释至50mL，混匀。将碳酸钠溶液缓缓倒入硫酸铜溶液中并混匀。在24h内使用。 5.3.1.3 碱性铜试液：取硫酸铜试液、50g/L十二烷基磺酸钠溶液、32g/L氢氧化钠溶液按1：2：

1混合，混合液室温下可保存2周。 5.3.1.4 福林-酚试剂稀释液：取5mL福林-酚试剂加55mL超纯水，置棕色瓶中室温保存。 5.3.2 各测试液的配制

5.3.2.1 待测溶液：溶解适量待测物质至适宜的缓冲液中得到一定浓度的溶液，溶液浓度应在标准

曲线范围内。适宜 缓冲液的pH值为10.0～10.5。 5.3.2.2 参考溶液：溶解适量蛋白参考标准物质于适宜缓冲液中，取部分溶液用相同缓冲液进行稀

释得到不少于5个不同蛋白浓度的参考溶液，其浓度等梯度均匀分布在5～100μg/mL之间。 5.3.2.3 空白溶液：使用制备待测溶液和参考溶液的缓冲液作为空白。

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标题 :总蛋白检查法（EP）

5.3.3 测定

5.3.3.1 精密量取每一浓度的参考溶液、待测溶液与空白溶液各1.0mL，分别加入碱性铜试液

1.0mL并混匀，室温放置10min； 5.3.3.2 再各加入福林-酚试剂稀释液0.5mL，混匀后室温放置30min。

5.3.3.3 在750nm波长处分别测定参考溶液与待测溶液的吸光度，同时以空白溶液作为补偿溶液。 5.3.4 计算

5.3.4.1 吸光度与蛋白质浓度之间呈非线性，但是如果标准曲线的浓度范围足够小，两者间会趋向

线性关系。以参考溶液的吸光度为横坐标，参考溶液的浓度为纵坐标作图，绘制线性回归标准曲线，得到回归方程，将待测溶液的吸光度带入回归方程，计算待测溶液中蛋白质的浓度。 5.3.4.2 线性回归方程如下：

yaxb

式中：

y——参考溶液的浓度，μg/mL； x——参考溶液的吸光度； a——斜率； b——截距。

5.3.4.3 按下式计算蛋白质的含量

C2式中：

C2——待测样品中蛋白含量，%；

C1 C0C1——待测溶液中蛋白的浓度（根据回归方程得到），μg/mL； C0——待测样品浓度，μg/mL。

5.3.5 去干扰物质

5.3.5.1 下述测定法中，通过在供试品中加入脱氧胆酸三氯醋酸使蛋白质沉淀，从而去除干扰物质。

此法也可用于稀溶液中的蛋白质浓缩。 5.3.5.2 取待测蛋白质溶液1mL，加入1.5g/L的脱氧胆酸钠试液0.1mL，涡旋混匀，室温放置

10min，再加入720g/L的三氯醋酸试液0.1mL，涡旋混匀，3000g离心30min，倾去液体并用吸管吸去残留液体，然后用碱性铜试液1mL复溶蛋白质沉淀物。 5.3.5.3 取复溶后的蛋白质沉淀物1.0mL进行测试，操作同”5.3.3测定”项下。

6 EHS要求 EHS requirements

本规程无特殊的健康、安全、环保要求。 7 参考和相关文件Reference & Cross Reference 《欧洲药典》（8.0版） 8 附录Appendix NA 9 历史记录History Page

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标题 :总蛋白检查法（EP）

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