隐花色素CRY2基因片段克隆及RNAi植物表达载体的构建

分子植物育种，２００８年，第６卷，第６期，第１１８２一ｌ１８６页　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００８，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．６，１　１８２—１　１８６　新思路、新技术、新方法　Ｎｏｖｅｌ　Ｔｈｉｎｋｉｎｇ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　隐花色素ＣＲＹ２基因片段克隆及ＲＮＡｉ植物表达载体的构建　周波孙梅阎淑滑李玉花　东北林业大学花卉生物工程研究所，哈尔滨，１　５００４０　通讯作者。ｌｙｈｓｈｅｎ＠１２６．ＣＯＩＴＩ　摘　要　隐花色素是植物向光反应的主要的光受体，介导蓝光／近紫外光调控的反应。在拟南芥中ＣＲＹ２调　节去黄化反应并控制开化时问。我们根据在ＧｅｎＢａｎｋ中已经发表的拟南芥（ＮＭ　１００３２０）、中国大白菜　（ＡＶ１７６６８９）、油菜（ＡＪ８８９７７９）ＣＲＹ２基因的ｃＤＮＡ保守序列设计并合成同源引物。通过ＲＴ—ＰＣＲ方法从‘‘津　田”芜菁（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｒａｐａ　Ｌ．ｓｕｂｓｐ．ｒａｐａ“Ｔｓｕｄａ’，）总ＲＮＡ中扩增出ＣＲＹ２基因的ｅＤＮＡ部分片段，采用ｇａｔｅｗａｙ　技术中的ＢＰ反应将其克隆到ｐＤＯＮＲ２２１中。测序表明，该片段与拟南芥具有８７％的同源性，与油菜和中国　大Ａ菜的同源性达９７％以上。采用ｇａｔｅｗａｙ技术中的ＬＲ反应，以植物表达载体ｐＨ７ＧＷＩＷＧ２（Ｉ）为基础，构　建了由组成型启动子３５Ｓ调控的ＣＲＹ２基因的ｉｈｐＲＮＡｉ植物表达载体。　关键词　隐花色素　ｙ２基因，ＲＮＡｉ，植物表达载体　ｅＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡｉ　Ｐｌａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｇｅｎｅ　ＣＲ　Ｙ２　Ｚｈｏｕ　Ｂｏ　Ｓｕｎ　Ｍｅｉ　Ｙａｎ　Ｓｈｕｈｕａ　Ｌｉ　Ｙｕｈｕａ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＦｌｏｗｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１　５００４０　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，ｔｙｈｓｈｅｎ＠１　２６．ＣＯＩＴＩ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｉｓ　ａ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ｆｌａｖｉｎ－・ｔｙｐｅ　ｂｌｕｅ／ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ・－Ａ　ｌｉｇｈｔ　ｓｅｎｓｉｎｇ　ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ．ＣＲ　Ｙ２　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｄｅ—ｅｔｉｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｉｎ　Ａ　ｌ＇￣２－　ｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｅＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆＣＲＹ２　ｉｎ　Ａ　ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＮＭ＿１００３２０），Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｃａｂｂａｇｅ　（ＡＹ１７６６８９）ａｎｄ　Ｂｒ￣ｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ（ＡＪ８８９７７９），ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｐａｒｔｉａｌ　ｅＤＮＡ　ｏｆ　ＣＲＹ２　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　Ｂｒ￣ｓｉｃａ　ｒａｐａ　Ｌ．ｓｕｂｓｐ．ｒａｐａ“Ｔｓｕｄａ”ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ．Ｔｈｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｓｈｏｗｓ　８７％ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｔｏ　ＣＲＹ２　ｏｆＡ　ｒａ５ｉｄｏｐｓｉｓ　ａｎｄ　ｏｖｅｒ　９７％ｉｄｅｎｔｉｙｔ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ　ｃａｂｂａｇｅ　ａｎｄ　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉａｌ　ｒｆａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＨ７ＧＷＩＷＧ２（Ｉ）ｂｙ　Ｇａｔｅｗａｙ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　３５Ｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｉｎｔｒｏｎ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＣＲＹ２　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｈｅｒｅｎｔ　ＣＲＹ２　ｇｅｎｅ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｇｅｎｅ　ＣＲ　Ｙ２，ＲＮＡｉ，Ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　隐花色素（ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ，ＣＲＹ）是首先在拟南芥　隐花色素是一种类光解酶的蓝光受体（Ｌｉｎ，　中发现的一种吸收蓝光和近紫外光（ｕｖ．Ａ）的光受　２０００）。目前，对拟南芥的ＣＲＹＩ和ＣＲＹ２功能的研究　体，它是一种黄素蛋（￣（Ｂｒｉｇｇｓ　ａｎｄ　Ｏｌｎｅｙ，２００１）。隐花　比较深入，它们在功能上既有重叠又有差别。ＣＲＹ１蛋　色素广泛存在于包括植物、动物包括人在内的真核　白介导蓝光信号调节的时钟节奏（Ｓｏｍｅｒｓ　ｅｔ　ａ１．，ｌ９９８），　生物的细胞内。隐花色素具有向光性、抑制幼茎伸　而ＣＲＹ２蛋白调节去黄化反应并控制开化时间（Ｇｕｏ　长、叶绿体迁移、刺激气孔张开和调节基因表达等功　ｅｔ　ａ１．，１９９８；Ｌｉｎ　ｅｔ　ａ１．，１９９８；Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａ１．，２０００）。在　能，与光敏色素一起调节植物的去黄化反应、光周期　ＣＲＹ１和ＣＲＹ２的Ｃ端包含一个可变区域，即功能　反应和光形态建成等反应。　区域（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａ１．，２０００），为蛋白～蛋白结合区，具有　基金项目：本研究由国家自然科学基金项目（３０５７１５１０；３０７３００７８）资助　隐花色素ＣＲＹ２基因片段克隆及ＲＮＡｉ植物表达载体的构建　，。，　ｃＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆＲＮＡｉ　Ｐｌａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆｔｈｅ　Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｇｅｎｅ　ＣＲＹ２　保守性，是蓝光信号向下游传递的延伸区域（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａ１．，　ｒ　ｓｉｃｎ　ｒａｐ０　Ｌ．ｓｕｂｓｐ．ｒａｐａ“Ｔｓｕｄａ’，）进行研究。将津　１９９６），而且其结合区可以与光形态建成的负调控因　田芜菁种子种植于人工气候箱中培养，温度保持在　子ＣＯＰ　１（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　１）的ＷＤ一４０　２４℃左右，光照１６　ｈ，当幼苗子叶展开长出真叶时取　区可以相互作用（Ｉｍａｉｚｕｍｉ　ｅｔ　ａ１．，２０００）。ＣＲＹ１和　材。试材来源于东北林业大学花卉生物工程研究所。　ＣＲＹ２的Ｎ端发色团结合区具有同源性，且其Ｎ端　菌株ＪＭ１０９购于宝生物（大连）有限公司，Ｔ．ｖｅｃｔｏｒ购　区域交换之后仍有生物活性（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａ１．，１９９６）；Ｎ端有　自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，Ｇａｔｅｗａｙ　ｐＤＯＮＲＴＭ　２２　１　Ｖｅｃｔｏｒ、　两种分子，一个是蝶呤（ｐｔｅｆｉｎ），另一个是ＦＡＤ（ｒａｖｉｎ　ＢＰ　ＣｌｏｎａｓｅＴＭ　ＩＩ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ、ＬＲ　ＣｌｏｎａｓｅＴＭ　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）。ＣＲＹ１和ＣＲＹ２都定位于细　Ｍｉｘ等购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。　胞核内。　隐花色素蛋白ＣＲＹ１和ＣＲＹ２均可能参与拟南　１．２津田芜菁总ＲＮＡ的提取　芥的向光性反应，并介导蓝光诱导的抑制拟南芥下　取生长一周左右真叶刚长出的津田芜菁幼苗为　胚轴伸长的反应。隐花色素的蛋白与辅基之间以非　试材，液氮研磨，采用改良２％ＣＴＡＢ法提取总ＲＮＡ　共价键连接，可以吸收蓝光和近紫外光。在拟南芥　ｆ周波等，２００８）。　中，ＣＲＹ２主要与控制花期和低照度光照下的形态建　１．３　ｅＤＮＡ的合成及目的基因的ＰＣＲ扩增　成有关。在短日照或是长日照下，ＣＲＹ２的过量表达　都会导致开花延迟，且腋生枝生长加强（Ｇｉｌｉｂｅｒｔｏ　ｅｔ　根据ＧｅｎＢａｎｋ中发表与芜菁亲缘关系相近的拟　ａ１．，２００５）。Ｍｉｙａｍｏｔｏ和Ｓａｎｃａｒ（１９９８）￣出隐花色素　南芥ｆＮＭ　１００３２０）、中国大白菜（ＡＹ１７６６８９）、油菜　也是生物钟光信号输入的受体。在低强度蓝光下，　（ＡＪ８８９７７９）ＣＲＹ２基因的ｃＤＮＡ保守序列设计并合　ＣＲＹ１作为ＰｈｙＡ（光敏色素Ａ，ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ａ１下游　成同源引物，ＰＣＲ克隆获得序列后按照Ｇａｔｅｗａｙ技　的一个信号转导组分；在中等强度蓝光下，ＰｈｙＡ失去　术手册设计加有部分ａｔｔＢ接头序列的引物和ａｔｔＢ接　作用，ＣＲＹ１和ＣＲＹ２充当光受体，介导了生物钟的　头引物，由上海生工进行合成ｆ表１）。　光输入过程；在高强度蓝光下，ＣＲＹ２失去作用，仅剩　按照ＢｃａＢＥＳＴＴＭ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．１．１（ＴａＫａＲａ）　下ＣＲＹ１充当生物钟光信号的受体（Ｄｅｖｌｉｎ，２００２）。　方法，以Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ为引物，津田芜菁总ＲＮＡ为模板进　从基因上对植物内源基因进行表达调控的途　行反转录反应：６５℃，１　ｍｉｎ；３０℃，５ｍｉｎ；６５℃，３０ｍｉｎ；　径有多种。ＲＮＡｉ是一种通过向细胞导入特定的双　９８℃，５　ｍｉｎ；５℃，５　ｍｉｎ合成ｃＤＮＡ。利用合成的引　链ＲＮＡ而引发的转录后基因沉默现象，首先在线　物，以ｃＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ反应，反应条件如下：　虫上被发现（Ｆｉｒｅ　ｅｔ　ａ１．，１９９８；Ｆｒａｓｅｒ　ｅｔ　ａ１．，２０００）。构建　９４℃预变性５　ｍｉｎ，９４℃，３０　Ｓ；５０℃，３０　Ｓ；７２℃，１　ｍｉｎ；　ｈｐＲＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）高效克隆和表达载体用于特定　共３０个循环，反应结束时，７２￣Ｃ继续延伸７　ｍｉｎ，将　基因表达调控是ＲＮＡｉ技术应用研究的热点之一，　ＰＣＲ产物回收与纯化、克隆、测序并分析。　当ｈｐＲＮＡ载体导入植物体后，在转录过程中产生　ｍＲＮＡ发卡结构，发卡茎部形成稳定的ｄｓＲＮＡ诱导　１．４植物ＲＮＡｉ表达载体的构建　同源的内源基因沉默。如果在靶基因的反向重复序　利用获得的目的片段为模板，序列内重新设计　列间加入一段非编码序列，如Ｉｎｔｒｏｎ，在植物体内转　表１　ＣＲＹ２片段及ａｔｔＢ接头引物序列　录形成含Ｉｎｔｒｏｎ的发卡结构（ｉｎｔｒｏｎ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｈｐＲＮＡ。　Ｔａｂｌｅ　ｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆＣＲＹ２ａｎｄ　ａｔｔＢ　ａｄａｐｔｏｒ　ｉｈｐＲＮＡ），则可以沉默大约８０％到１Ｏ０％的转化株　Ｎａｍｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａ１．，２０００）。　ｌ　ｌ，２一Ｆ　５　ＧＡＧＴＴＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＡＧ一３　本文对芜菁ＣＲＹ２基因片段进行了同源克隆并　Ｃ　，，２一Ｒ　５ＬＴＡＧＣＣＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＴＣＡ一３。　采用Ｇａｔｅｗａｙ技术构建了能形成发卡结构的ＲＮＡｉ　ａｔｔＢ．ＣＲｙ２一Ｆ　５＇－ＡＡ　ＡＡＡＧＣＡＧＧＣ　ＴＴＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＡＧＡ　表达载体，该研究对ＣＲＹ２在滓田芜菁光信号转导　ＣＴＡＣＧＣ一３’　和形态建成中的作用与功能研究具有重要的意义。　ａｔｔＢ．ＣＲ　ｙ２一Ｒ　５＇－ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＣＡＡＣＧＧＡＴＡＣＣＣ　ＡＧＴ一３’　１材料和方法　ａｔｔＢ－－ａｄａｐｔｅｒ－・Ｆ　５＇－ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡ　ＧＣＡＧ　１．１材料　ＧＣＴ一３’　ａｔｔＢ－－ａｄａｐｔｅｒ—・Ｒ　５＇－ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧ　本实验采用花青素合成光敏感的津田芜菁　ＧＴ一３’　m4淼臻attB。…。g加有部分PCR接头序列的引物进行pDONR221JMl09~PCR，利用此，法获得了津田芜菁中相关的一CRY2基因序列片段。体系与质粒进行BP反应。将BP反应后的溶液转化，37C过夜培养。从平板上LR22中间载体pDONR221CRY2．与表达载体pH7G—挑取单菌落进行PCR与测序鉴定JMl09利用线性化的重(I)进行反应，，~WIWG2(I)CRY2一的构建a组载体与表达载体pH7GWIWG2，通过因片段BP，PCR扩增获得含有attB位点的CRY2基将LR反应后的溶液转化平板上挑取单菌落进行37C，过夜培养从与带有ttP，位点的载体质粒，pDONR221在，PCR。鉴定详细步骤方法参克隆酶的作用下进行体外重组得到入门克隆、考佟友丽等(2007)的文章2经PCRGatew测序均证实成功获得阳性重组克隆。采用检测ay技术中的LR反应，以植物双元表达载体，结果与分析．pH7DONR将所构建的植物表达载体经400bpPCR，，21津田芜菁CRY2片段eDNA的克隆RNA，得到果进行反转录一一条长约，的特异性。DNA片段与预期结致(图4)说明构建正确利用CRY2同源引物，对总PCR获得了约400bp的片段(图1)此片段回收克隆3讨论Gatew，ay克隆技术是一种新发展起来的克隆技，术它代替了限制性内切酶和连接酶的作用大大精简了克隆的步骤，。与传统的克隆技术相比这种转移，。不仅快速方便并且保持了基因定位和阅读框架因沉默(gen2000bpl000750500250100es基ilencing)是转基因植物中特定基因由于。种种原因不表达或表达量很低的遗传现象可以有，bpbpbD‘选择地抑制特定基因的表达来创造功能缺失体利用反向遗传学方法进径研究表明一步研究基因的功能。也为研bbbp究植物基因表达调控及鉴定基因功能提供了新的途。，自我互补的发夹(hpRNA)结构在植．图1CRY2片段cDNAPCR扩增产物电泳图注：MCRY2Figure：：DNAMarker(DL2000，TAKARA)；CRY2：津田芜菁基因片段的1ElectroPCRres结果o物上会有效的产生基因沉默现象(Wesleyeta12001)当发夹结构中反向重复序列中间的核酸序。，phoisrfthefragm，entofCRY2cDNAbyPCR：列是内含子时基因沉默效率会很高这种结构称，，NotefragmMt：oDNAMarke(DL2000rassTAKARA“)；CRY2’’400bp为ihpRNA。利用传统的基因克隆技术和PCRGatewayenfCRY2geneinBicarapaTsudabyPCR系统结合将目标基因的，，产物直接插入到载体e中会形成高效沉默系统(Helliw至T．llandWaterhouse，vector进行序列测定，，片段命名为BrCRY2序片2003)，而且沉默效果比较稳定。Stoutjesdijk，等(2002))来沉5列分析表明具有87％该片段序列与拟南芥CRY2片段序列，构建了不同形式的发夹结构(hpRNA默FAD2，ihpRNA，的同源性与油菜和中国大白菜以上(图2)。CRY2基因结果得到了高沉默程度植株繁殖。段序列的同源性达CRY297％代后沉默程度也没有降低一虽然通常认为hpRNA载，是隐花色素家族基因成员之，，介导蓝光CRY2体设计时靶基因序列应选择基因编码区片段但采，信号的转导调控相应的光形态建成反应有抑制下胚轴伸长诱导、。具用目的基因的以及用3'5'UTR片段(Stoutjesdijketa1．，2002)CHS(chalc。onesynthase)基UTRrumme序列的反向重复片段连接于目的基lle因表达促进花青素合成等功能、CRY2，蛋白具有光目前已经在，因片段(Bta12003)构建的载体转化时．，，植编的不稳定性，，在高光下含量迅速减少而在低光下富。株仍可表现出基因抑制现象码区特异片段和GatewihpRNAa。我们则利用CRY2CRY2集这有利于植物在低光环境下生长、、y技术成功构建了拟南芥大麦番茄白菜油菜等植物中克隆了相关、、表达载体CRY2RNAi。的CRY2基因。在没有相关数据库可供利用时通过，本论文通过同源克隆的方法成功地从津田芜菁相近物种的功能基因的序列进行同源克隆是快速有中克隆到了构建了双元基因的片段，利用Gatewa一y技术，效的获得所研究试材基因的方式，我们通过这种方表达载体pH7GWIWG2(I)CRY2隐花色素eCRY2x基因片段克隆及ecRNAi植物表达载体的构建eDNACloningandConstructionofRNAiPlantEpressionVtoroftheCryptochromG1185eneCRY2BrassicarapaGAGTTCATCGGAGTTCATCGTCAc删TCGGAG…GTT0AGAAGCAG霉ChinBesecabbagepusAGAAGCAGGAAAGCACAGArassicana~T争CTArabidopsisConBsensusGATAGATTAT嗣CTCGCAAAGAACAGCAAAGAACAGCAAAGAACAGCAAAGAACA*董*****鼍**GCAAGAAAGTGCAAGAAAGTGCAAGAAAGTGCAAGAAAGT量*jI蕾*量誊*誊蕾rassicarapaTTGGeChinesecaabbagpus~ABrassicna：：主：；；器震AAGCGTCATAAGCGTCAGCAGcGTcTAAGGCGArabidopsis~囊篡iii辜瓣群圈辫蔫霪器ATCTCCA董*量{I~TCGGGGATTCGGGGA黼~TTCGGGGA鼬辩*CoBnsensus*量量鼍鼍鼍****瞢*rassicarapaChinBrArCoBrCBesecabbagepusassaicanabidopsisii瓣鳃至三蘩鬟蕤黪CDCGT~一一cGTTTGOATGAAACAGGATGAAACAAAAATATGGTATGG∽∞TC擎絮糕C爨CGT~YTCcA秘G擎cc囊GGATGAAACAGGATGAAACA普*瞢瞢鼍*壬壬*AATATGGAATTATATGG**nsensus鼍***瞢***ATTTAAhinesecabbagAeGGGass戮A戴icaArapa麟黍rassicanapusArabidopsisii簸茭i兰茎簸GAAC：：主：黧主~mAAAGAGAAGGAG黧~AGAA薄AGCGAG鼍量AGGAGGAA藜*G*鲁萎i辜辜i辜i三辜鋈蓁蓁GT；量*G笨秘AAGGG订AATGTGTGTCCCCACoBnsensusC**TATAC*鲁CT量AT量C量量rassicarapaChinBesecabbagepusrassicanaArabidopsissensus障篓麟G~ATCG~~三瓣GAAZCOGTTTAAGAGAGT群器ATTCTCGGTA*AATATGGGTTTTATATGTTTCTTTT**T|}*T*董量鼍*AT辫T嚣TATCelfTTTCCAAACT喇书硐州~CAACTTCCC需TAACTTCCCGT**量*量鼍三墓量粪CCTTcc。C*Con***量***CCC鼍**BrassicarapaeChinesBrassecabbagpusTTicana~…CTCACGArabidopsisCoBnsensus瓣寨搴**ItCCCTTGGGATCCCTTGGGATCCCTTGGGATGGTTTTT*蕾鼍鼍鼍atCCCTTGGGAT*量**41鼍*蕾at*鼍**量鲁rassicarapaGCTGeTTGTGGA鼬AGTTCAAAAGTTCAAA黎GGC~GGCeecGGAGACAAGCAAGChinBesecabbagpusGCTGGCTGGCTG*鼍量*~TGGAGA~*rassicanaTGGA爨AAGTTCAAeGAGACAAGArabidopsissensusConB}*量*鼍****量****蕾鼍蕾量*鼍***鼍**鼍鼍***量鼍*I壬**rassicarapaGTTGGTGGATGTTGGTGGATChineseBrAasscabbagepus黔TGAG飘TGAGG躲TGAGAGAGCTTTGGAGAGCTTTGGGCTAGGCTAGGCTAicanaGTTGGTGGATGTTGGTGGAT瞢*鲁量**量*量GAGAGCTTTGGAGAGCTTTG量rabidopsisGCCGGAATGA鼍鼍GGCTA**Consensus*****量蔷量****鼍**鼍鼍鼍*图2津田芜菁reCRY2片段与拟南芥中国大白菜油菜片段序列的、、一致性比较一注：ClustlW分析津田芜菁拟南芥中国大白菜油菜的CRY2片段序列、、、致性方框表示有差异的碱基阴影表示相同的碱基，，FiguBN2ManaultipleusalignmentofthefragmentsequencesofCRY2amongBrassic“arapaTsuda”，Ar曲id0Ps函Chin，esecabbage，andrassicpote：TheCRY2rectannucsleotidediferensequencesofBnrassicarapa，Chinesecabbagen，BrassicanapusandArabidopsiswerealignedbyClustlW．ThegleshowtnucleotidesadtheshadowindicatesideticalnucleotideattRl—a”“——。ttR2artR2’attRlf——r—一‘————_J、'r。。一00。一LBHygT35SpH7GWIWG2(I)CRY2󰀀CJRy2CRY2P35SRB图3重组表达载体Figure3Thesc的结构示意图nhemeofrecombinantexpressiovectorpH7GWIWG2(I)CRY2󰀀m6德淼M。…。g(獬陀cleocytoplasmicdistributioanandgeneAdionexpressiocanarereguirs—latedbylightquPlantCellLinC．lityinthefemtumpillus．vene，，12(1)：8196—，2000—，Plantbluelightreceptors，TrendsPlantSci．，5(8)：337342000bpLinC．，AhrnadM．，ChaonJ．，andCashmorecrAR．．，1996，CRY2m：A瓣图4重组表达载体的PCR电泳检测Figure4PCRdetectionosecondmember．．ftheArboidopsis：104ryptochomegenefaily，PlaLinC．ntPhysi01an110．7，YgH．，GuoH，MocklerTe．，ChenJ．，andCashmooreAR．，1998，Enhanceexmentofblulight，lightsensitivcrityfArboidopsisefrecombinantpressionvectorseedlingsby．ablue．receptor—yptochrom2，Proc．NatlAcadSci．，USA95(5)：26862690．这为即将进行的遗传转化有目的的突变掉津田芜菁CRY2MiyamotoY．，andSarsncarA，1998，VitaminB2basedbluelight基因研究其介导的信号转导和所起的功能提，。photoreceptotoacinthets．retinohypothalamictractcasthephomam供了基础tive，pig．menofcarsetting．the，circadianlockin．—malsProcNatlA．dSci．，USA．95(11)：60976102．．参考文献BriggsWR．．SmithNAan．，SinghSP．．，W．angMB．，StoutjesdijkPA，GreenAG．．，dWaterhousePM．，2000T，，o，andOlneyMA．．，2001Photo，．receptorsinplantphoes，talsilencingbyintronspliced—tomorphogenesistochromes，todateif，veanphytochromhairpinRNAs，Nature407an：319320．．twome，crypnSotmersanDE．．，DevlinPF…onephototropin󰀀donesuperchroPladKaySAen，1998，PhytochrraomescdPhysi01Brumme．，125．：8588cacryptochroc，mesinthe，trainme—ntoftheAbidopsisir—dianlockScience．．282．：14881490．llDA．．，B，alintKurtiPJ．．，Harpster．MH．．，PalysreeJM．．，OellerPW．andGuRersonN，2003gion，Invfore~edpeatofaStoutjesdijkPAPA．．，SinghSP．，LiuQ，，HurlstoneCJ～—Waterhouseoheterologouhighthro󰀀s3untranslatesd，rehigh—if—ciency，anradGreenAG．．，2002nehpRNAesmediatedtargetingef，ughputgene，ilencingPlantJe：env：15os．，33(4)：793800talinputtothetheAsbidopsisFAD2ge，．givhighlyifcientandstableDevlinPF．．，2002nSign，．soxfthetim．ironmenilencingPlantPhysi01．，129(4)：17231731．circadia．clockJM．EpBot．．，53．351550SA．．TongYLDrivticer．，ZhaoF．，FengJW．，andLiYH．．，2007，CloningnonftuFireA，XuS．，ontgomeryMK，，Ktas，SE．．，andrtanscriptionfactonvecrDREBlAgeneanedconstructio，ofplaMelloCC．，1998Potentandspecenorificgeneeinterfns，exerencepressiotorbyersgatewayclonotechnique，Shengw—bydouble39lFraser：80——s~andedRNAinCahabdit~legaNatureJishuTongx，，un(Let，inBiotechn，，logy)，18(2)：2052086811Kama(佟友丽赵飞冯君伟李玉花2007转录因子DREBlAthR，．AG．．，S．，Zipperlen．P．，M，artinezCaamposMom基因的克隆与．Gateway—克隆技术构建植物表达载体生，，SohrmanaannoM．andAhringerJns，2000Functionslgenic—物技术通讯Wesle，18(2)：205208)elysisfc．elega，chrom：32—osomeIbyystematicRNAinySV．．，HelliwllCA．．，SmithNA．．．，WangMB．．．，RouseDT．．．，terferencetNaurrore，408．5330LiuQGoodingPS．，…SinghSPAP．．．，AbboRDAG．．，StoutjesdijkPA．．，GilibertoL．，Pe．tta，G，Pallara．P．，WellerJL．．，FraoserPD．R．obins，onSP．．，Gleave，Greeen，andWaterhousePMtivean．，，BramanleyPMipulatioan．FioreA，TavazzaM．，andGiulianptot，．G．，2005e，2001Constructdesignuforif，cient，ef．ecdhighthro———Mofthebluelightphototsverecercryptochrom2Y，hputge．．nesilencniginplants．PlantJ．，27(6)：581590．intomantoafecgetativedevelopmconenlfoweirng—timeangH．QWu，．YJ，．，TangRH．．，LiuDo，LiuY，andCashmoreesdfruit．antioxidantoctent，PlantPhysi01．，137，：199208noAR，2000aTheCterminilight．fArobidopsis，，cryptochromGuoHlf，YangH．，MeklerTC．，andLinC．，1998Reuglatioptors，f：mediate．constitutiveresponse．．Cell103(5)：815827，owe一irngtimbyArboidopsisphotoreceScience，279ZhouB，WangY．，SunM，ansudLiYHdaTuum，2008eDNAcloningexosf—13601363HelliwebZIPproteinHY5inTipuzanrptditstransciprellC．，andWuaterhousePnes．，2003nc，Constructsa，ndmethods，sionanalysis，，Fenzi．ZhiwY，hong，，(MolecularPlant，forhighthro—ghputgeileinginplantsMethods30Breeding)6(1)：5964(周波王宇孙梅李玉花e2008，，津(4)：289295—田芜菁bZIP蛋白HY5gaeDNA的克隆及表达特性分子ImaizumiT．，KaneT．，andWadaM．，2000Cryptochrom，enu—植物育种，6(1)：5964)．