补肾化痰祛瘀法对血管性痴呆大鼠认知功能的保护作用

２０１３年１１月第５１卷第３１期　・论　著・　补肾化痰祛瘀法对血管性痴呆大鼠认知功能的　保护作用　陈江瑛　闫振文２　邓婉青　张素平　１．暨南大学医学院第四附属医院广州红十字会医院神经内科，广东广州５１０２２０；　２．中山大学附属第二医院神经科。广东广州５１０１２０　【摘要】目的研究补肾化痰祛瘀方对血管性痴呆（ＶａＤ）大鼠认知功能的改善作用。方法在缺糖缺氧培养条件　下，观察补肾化痰祛瘀方血清对体外培养的海马神经元的保护作用。用双侧颈总动脉永久性结扎法（２ＶＯ）制备　ＶａＤ大鼠模型，造模前予灌胃治疗，Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试治疗后ＶａＤ大鼠认知功能的改善情况，ＴＵＮＥＬ染色测定　各组大鼠海马脑组织内细胞凋亡的变化。免疫组织化学方法检测Ｂｃｌ一２、Ｂａｘ蛋白表达。结果在缺糖缺氧培养　条件下．体外培养海马神经元出现大量的细胞凋亡，而预先加入补肾化痰祛瘀方的血清进行处理后，细胞凋亡　率明显下降。补。肾化痰祛瘀方灌胃治疗的ＶａＤ大鼠，与未予治疗的ＶａＤ大鼠组相比，治疗组大鼠找到平台的潜　伏期缩短（Ｐ＜０．０１），穿越平台次数增多（Ｐ＜０．０１）；与痴呆组相比，补肾化痰祛瘀方治疗组大鼠脑组织海马区　凋亡细胞数明显减少，抗凋亡基因Ｂｃｌ一２蛋白表达显著增加，凋亡基因Ｂａｘ蛋白表达降低，差异有统计学意　义（Ｐ＜０．０１）。结论补肾化痰祛瘀方对大鼠体外培养和脑组织内海马神经元具有神经保护作用，补肾化痰祛瘀　方治疗可以明显改善ＶａＤ大鼠的认知功能。　【关键词１补肾化痰祛瘀方；血管性痴呆；认知功能；细胞凋亡　【中图分类号】Ｒ２７７．７　【文献标识码】Ａ　【文章编号］１６７３—９７０１（２０１３）３１—０００１—０３　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇ　ｋｉｄｎｅｙ，ｄｉｓｓｉｐａｔｉｎｇ　ｐｈｌｅｇｍ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｓｔａｓｉｓ　ｒｅｃｉｐｅ　ｏｎ　ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ　ＣＨＥＮ　ＪｉａｎｇｙｉｎｇＩ　ＹＡＮＺｈｅｎｗｅｎ。ＤＥＮＧ　Ｗａｎｑｉｎ￣ＺＨＡＮＧ　Ｓｕｐｉｎｇ￣　１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ＆ｔｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｊｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１　０２２０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａｆｉｆｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｓｕｎ　Ｙａｔ—ｓｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０１２０，Ｃｈｉｎａ　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ　ｒａｔｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａ　ｐｅｒｍａｎｅｎｔ　ｂｉｌａｔｅｒｌａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｃａｒｏｔｉｄ　ａｒｔｅｒｉｅｓ（２ＶＯ）ａｆｔｅｒ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇ　ｋｉｄｎｅｙ，ｄｉｓｓｉｐａｔｉｎｇ　ｐｈｌｅｇｍ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｓｔａｓｉｓ　ｒｅｃｉｐｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ＳＤ　ｒａｔｓ．Ａｔ　ｏｘｙ—　ｇｅｎ—ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇ　ｋｉｄｎｅｙ，ｄｉｓｓｉｐａｔｉｎｇ　ｐｈｌｅｇｍ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｓｔａｓｉｓ　ｒｅｃｉｐｅ　ｏｎ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　２ＶＯ．Ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ＶａＤ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇ　ｋｉｄｎｅｙ，ｄｉｓｓｉｐａｔｉｎｇ　ｐｈｌｅｇｍ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｓｔａｓｉｓ　ｒｅｃｉｐｅ．Ｍｏｒｒｉｓ　ｗａｔｅｒ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＶａＤ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｎｅｕｒｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｃｌ——２　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｂａｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｌｅｎｔｙ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｅｎ　ｉｎ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｆｔｅｒ　ｏｘｙｇｅｎ—ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ，ｗｈｉｌｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｍｕｃｈ　ｄｅ—　ｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｌｅｐｔｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｈａｓ　ａ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉ－　ｃａｎｃｅ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ＶａＤ　ｇｒｏｕｐ，ｌｅａｒｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｅｍｏｒｙ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｗａｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｉｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ＶａＤ　ｒｇｏｕｐ．Ｎｅｕｒｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ　ｆｒｏｍ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ｒｇｏｕｐ　＜Ｏ．Ｏ１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇ　ｋｉｄｎｅｙ，ｄｉｓｓｉｐａｔｉｎｇ　ｐｈｌｅｇｍ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｓｔａｓｉｓ　ｒｅｃｉｐｅ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｔｅｃｔ　ｈｉｐｐｏｃａｍ—　ｐａｌ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｂｙ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇ　ｋｉｄｎｅｙ，ｄｉｓｓｉｐａｔｉｎｇ　ｐｈｌｅｇｍ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｓｔａｓｉｓ　ｒｅｃｉｐｅ　ｉｎ　ＶａＤ　ｒａｔｓ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｉｎｖｉｇｏｒａｔｉｎｇ　ｋｉｄｎｅｙ，ｄｉｓｓｉｐａｔｉｎｇ　ｐｈｌｅｇｍ　ａｎｄ　ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｓｔａｓｉｓ　ｒｅｃｉｐｅ；Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ；Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ　ｆｕｎｃ—　ｔｉｏｎ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　血管性痴呆（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＶａＤ）是由一系列脑血　管因素（缺血或出血或急慢性缺氧性脑血管病等）导致脑　［基金项目】广东省广州市中医药、中西医结合科研课题（２００９Ａ２５）；广　组织损害。引起以认知功能障碍为特征的综合征［１　．。血管　东省中医药局科研立项（２０１００２０）；广东省医学科研基金立项（Ａ２０１　性痴呆属于中医学“呆病”范畴，其病位在脑，其本在于心　３５０６）；广东省广州市卫生局一般引导项目（２０１３１Ａ０１１０４７）　肝脾肾的功能失调；其标在于痰浊癖血，蒙闭清窍，致神机　ＣＨＩＮＡ　ＭＯＤＥＲＮ　ＤＯＣＴ０Ｒ中国现代医生　１　・论　著・　目，计算细胞凋　率。　２０１３年１１月第５１卷第３１期　失州。补肾化痰祛瘀方具有补肾填精，益髓充脑，使脑髓得　充，气血得益，兼化癖浊，开脑窍的作用　。本研究采用补　肾化痰祛瘀方脑内注射治疗ＶａＤ模型大鼠，观察其对ＶａＤ　大鼠认知功能的改善作用。　１材料与方法　１．１实验材料　１．２．２血管性痴呆大鼠模型的建立及分组处理将雄性ＳＤ　大鼠用ｌ０％水合氯醛（０．０３５　ｍＬ／ｌＯ　ｇ）腹腔注射麻醉后。分　离双侧颈总动脉，并以４号丝线阻断血流２０　ｍｉｎ。可以观　察到大鼠惊厥、呼吸深慢、心跳加快；同时在距鼠尾尖约　１　ｃｍ处断尾，放血约０＿３　ｍＬ。松开丝线扣恢复血流１０　ｍｉｎ　后，再次阻断血流２０　ｍｉｎ。如此重复３次，第３次血流再灌　注后观察３０　ｍｉｎ，如大鼠呼吸、心跳平稳，即可缝合皮肤，　放叫笼巾正常饲养。其巾假手术组仅分离双侧颈总动脉，　套丝扣；但不阻断血流．尾部不放血，观察时间、饲养条件　１．１．１动物出生后第１天ＳＤ大鼠４只：老龄健康雄性ＳＤ　大鼠６５只，月龄＞１６个月．体重３００～４５０　ｇ，由巾…大学北　校区实验动物巾心提供。　１．１－２药物补肾化痰祛瘀方为熟地、…茱萸、枸杞子、制首　乌、菟丝子、桃仁、红花、当归、川芎、丹参、制半夏、炙远志、　石菖蒲、胆南星、枳实等组成，经水煎制成浓缩液，高、低剂　量组分别相当于含生药２　ｇ／ｍＬ和１　ｇ／ｍＬ。　１．１．３试剂Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ａ（Ｇｉｂｃｏ），Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ），胎牛血清　（Ｓｉｇｍａ），胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ），多聚赖氨酸（Ｓｉｇｍａ），阿糖胞苷　（上海华联制药有限公司）　１．２实验方法　１．２．１补肾化痰祛瘀方对体外培养海马神经元的保护作用　（１）海马神经元的培养取出生１　ｄ的ＳＤ大鼠，在无菌条　件下分离出双侧海马，充分剪碎，加入０．１２５％胰蛋白酶，　在３７℃水浴巾温育３０　ｍｉｎ，１０％胎牛血清终止消化，小心　地吸除胰蛋白酶液，加入５　ｍＬ　ＰＢＳ，轻柔地震动混匀，静置　５　ｍｉｎ；吸除上清，加入５　ｍＬ　ＰＢＳ，用吸管吹打分散组织制　成细胞悬液，用台盼兰染色以了解细胞活性：按１　Ｏ００／ｃｍｚ　的密度接种于有多聚赖氨酸包被的培养瓶中，加入含１０％　胎牛血清的Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ａ＋Ｂ２７的培养基５　ｍＬ．于３７℃含　５％ＣＯ：的培养箱中培养。培养２４　ｈ后用Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ａ＋Ｂ２７　无血清培养基全量换液，以后每周换液２次．每次更换一　半新鲜培养液。在神经元接种３　ｄ后加入终浓度为３　ｍｇ／Ｌ　的阿糖胞苷，以抑制神经胶质细胞的增殖［５１。（２）补肾化痰　祛瘀方药物血清和空白血清的收集ＳＤ大鼠灌胃给予补　肾化痰祛瘀方的浓缩液，相当于生药量为２５　ｋｇ，２次／ｄ，　给药７　ｄ，末次给药２　ｈ后，无菌条件下，心室内取血，分离　血清，５６ｃＣ补体灭活，一８Ｏ℃冻存备用。用于实验时，用完全　培养基分别稀释成５％、１０％、２０％　种不同浓度的含药血　清。空白血清的获得是予ＳＤ大鼠灌服０．９％生理盐水连续　７　ｄ，给药时间、方法和获取血清方法同补肾化痰祛瘀方。　（３）缺氧缺糖试验取培养１２　ｄ的海马神经元，按实验分　为对照组、空白血清组和补肾化痰祛瘀方组．在缺糖缺氧　前２４　ｈ，按如下方案给药：①培养基组，②空白血清组，　③５％含药血清组，④１０％含药血清组，⑤２０％含药血清组，　更换无糖平衡盐缓冲液（１１６　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，５．４　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣ１．　０．８　ｍｍｏ］／Ｌ　ＭｇＳＯ４，１．１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４，２６．２　ｍｍｏ］／Ｌ　ＮａＨＣＯ３，　１．８　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣ１　）。然后将各组细胞同时移至恒温（３７℃）　密　容器内，连续充以无氧气体（９０％Ｎ　、１０％ＣＯ　），在缺糖　缺氧条件下分别培养１　ｈ、４　ｈ、１２　ｈ后，进行细胞凋　分　析。（４）细胞凋亡分析将上述在缺糖缺氧环境下培养的细　胞，先经４％多聚甲醛固定３０　ｒａｉｎ后，然后采用甩片法将　细胞贴壁在玻片上，加入ＴＵＮＥＬ反应试剂，在显微镜下观　察并计数相邻视野ＴＵＮＥＬ阳性染色及阴性染色神经元数　２　中国现代医生ＣＨＩＮＡ　ＭＯＤＥＲＮ　ＤＯＣＴＯＲ　与模型组相同。造模前大鼠随机分成６组．每组１０只：正　常组。假手术组，模型组，尼莫地平组，补肾化痰祛瘀方低　剂量组，补肾化痰祛瘀方高剂量组。补肾化痰祛瘀方低、高　剂量组分别给大鼠灌胃该药水煎液，相当于生药量１０．０　ｇ／　（ｋｇ・ｄ）和２０．０　ｇ／（ｋｇ・ｄ），正常组、假手术组、模型组均给　予等容积的生理盐水灌胃；而尼莫地平组灌胃用尼莫地　平混悬液１０　ｍｇ／（ｋｇ・ｄ），手术当天提前２　ｈ灌胃，直至术后　１５　ｄ。在灌胃后３０　ｄ．分别对上述各组大鼠进行水迷宫试　验，观察各组大鼠学习和记忆成绩。　１．２．３　Ｈ０　ｒ　ｒ１　Ｓ水迷宫测试（１）定位航行试验水温控制　在２５ｃｃ左右，每日上下午各４次，将大鼠面向池壁分四个　象限放入水中．记录其在２　ｍｉｎ内寻找到平台的时间（逃避　潜伏期）。如果大鼠在２　ｍｉｎ内未找到平台，则　手牵引其　至平台上，让大鼠停留２０　Ｓ，再放回笼巾，其潜伏期算１２０　Ｓ。　历时５　ｄ。（２）空间探索试验第６天撤除平台，将大鼠仟选　１个入水点放入，卜己录其２　ｍｉｎ内跨越原平台位置的次数。　１．２．４免疫组织化学检测ＢＣ１—２、ＢａＸ阳性细胞的表达各　组大鼠在行为测试完毕后以１０％水合氯醛麻醉，立即奸胸　暴露心脏，左心室迅速插管至主动脉，同时剪开有心耳，灌　注生理盐水１００　ｍＬ．：再灌注４％的多聚甲醛２５０　ｍＬ．速度　先快后慢，至颈部非常僵硬为满意．迅速取脑并分离左侧　海马区组织，４％多聚甲醛中浸置４～６　ｈ，经乙醇常规脱水、　二甲苯透明后，浸蜡包埋，５　ｍ厚切片，行免疫组化染色，　严格按照说明操作。　１．３统计学处理　应用ＳＰＳＳ统计学软件，计量资料数据以均数±标准差　（　±　）表示，方差齐性检验以ａ＝０．１为检验水准。组问比较　应用单因素方差分析，各实验组间的两两比较采，Ｌ｝ｊ　ｑ检　验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结果　２．１　ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡率　ＴＵＮＥＬ阳性染色光学　微镜下细胞胞核呈棕黄色．缺　氧缺糖后，随着缺氧缺糖时间的延长凋　细胞逐渐增多。　凋亡的神经元表面皱缩，体积缩小，细胞核固缩，有时可见　碎裂成数个圆形颗粒的凋亡小体。培养基组和空白血清组　之间无明显差异（Ｐ＞０．０５）。经补肾化痰祛瘀方预处理的　海马神经元细胞凋亡数目明显减少，凋亡神经细胞发生率　与培养基组、空白血清组比均有显著性差异（Ｐ＜０．０５），且　与含药血清浓度具有相关性。在三种不同浓度的含药血清　组间．２０％含药血清细胞凋亡率最低。见表１。　２０１３年１１月第５１卷第３１期　表１　ＴＵＮＥＬ法检测神经细胞凋亡率（ｉ±ｓ，ｎ＝ｌ０）　组别　细胞凋亡率（％）　１　ｈ　４　ｈ　１２　ｈ　对照组　ｌ８．６５＿＋１．３５　３５．７ｌ±４．０２　４７．６７￣５．０４　空白血清组　２０．３２＋２．１３　３６．５２＿＋４．６５　４８．５２￣４．２２　补肾化痰祛瘀方５％含药廊清组ｌ３．４１±１．２８　２０．５ｌ±４．８８　３３．４８－－．４．８２　补肾化痰祛瘀方１０％含药血清组９．５７＋＿２．Ｏ３　１４．７３＋２．６１　２５．３４＋３．７２　补肾化痰祛瘀方２０％含药血清组７－２１±２．７２　１０．１４－－．１．７　２Ｏ．１２￣５．３１　注：与培养基相比，　＜０．０５，　＜０．０１，与空白血清组相比，　＜０．０５，　．Ｐ＜０．０１，方差分析表明，在ｌ　ｈ．４　ｈ和１２　ｈ各时间点，Ｆ值分别为８１．６６，　ｌ１６．５２和７６．０９．Ｐ＜０．０ｌ　２．２　Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验结果　模型组所用逃避潜伏期时间明显长于空白组、尼莫地　平组、补。肾化痰祛瘀方高剂量组及低剂量组，均有显著差　异（Ｐ＜０．０１）。补肾化痰祛瘀方高剂量组逃避潜伏期时间　较尼莫地平组减少，差异有统计学意义。空间探索试验结果　显示．补肾化痰祛瘀方高剂量组、低剂量组、尼莫地平组跨　越平台次数均高于模型组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。　补肾化痰祛瘀方高剂量组逃避潜伏期时间、跨越平台次数　高于尼莫地平组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。见表２。　表２各组大鼠水迷宫实验比较（　±ｓ）　注：与假手术组相比，　＜Ｏ．０１，与模型组相比，－Ｐ＜Ｏ．０５，－ｐ＜０．０１　方差分析表明，潜伏期和跨越次数，值分别为：３５．２０和１２．７４．Ｐ＜Ｏ．０１　２．３各组大鼠海马ｃＡ１区Ｂａｘ，Ｂｃｌ－２蛋白的表达　与假手术组比较，模型组凋亡基因Ｂａｘ蛋白表达显著　增加（Ｐ＜０．０１），抗凋亡基因Ｂｃｌ一２蛋白表达显著下降（Ｐ＜　０．Ｏ１）。与模型组比较，尼莫地平组、补肾化痰祛瘀方低剂量　组、补肾化痰祛瘀方高剂量组抗凋亡基因Ｂｃｌ一２蛋白表达　显著增加（Ｐ＜０．０１），凋亡基因Ｂａｘ蛋白表达降低（Ｐ＜０．０１）。　说明补肾化痰祛瘀方可能通过影响凋亡相关蛋白的表达　而发挥神经保护作用。补肾化痰祛瘀方高剂量组与尼莫地　平组相比，Ｂｃｌ一２蛋白表达增加，Ｂａｘ蛋白表达下降，差异　有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。见表３。　３讨论　中医认为。血管性痴呆是在精气亏虚的前提下产生瘀　血、痰浊后形成的本虚标实、虚实夹杂证，补肾化痰祛瘀法　补肾填精治其本，化痰祛瘀治其标，标本兼顾，故对血管性　痴呆有防治作用。补肾化痰祛瘀方是在醒脑益智方和加味　温胆汤的基础上化裁而来．方中的枸杞子具有增强造血功　能、降脂、调节免疫、延缓衰老等作用，制首乌、菟丝子可增　加脑组织ＳＯＤ活性．山萸肉滋补肝肾，桃仁、红花、当归活　血祛瘀。菖蒲化痰开窍．共奏补肾固本、化痰祛瘀开窍之　・论　著・　表３补肾化痰祛瘀方对大鼠凋亡细胞、Ｂｃｌ一２蛋白及Ｂａｘ蛋白的影　响｛ｉ　，％。个／视野Ｊ　注：与假手术组相比，　＜０．Ｏ１，与模型组相比，　＜０．０５，　．Ｐ＜０．０１，　方差分析表明。凋亡细胞、Ｂｃｌ一２蛋向及Ｂａｘ蛋白，值分别为：ｌＯ１．４６、　ｌ５３＿３５和１８３．６２．Ｐ＜０．０１　功。全方配伍，具有补肾填精，益髓充脑，使脑髓得充，气血　得益，兼化癖浊，开脑窍的作用，从而达到治疗ＶａＤ的目　的。在本实验中，我们采用补肾化痰祛瘀方对血管性痴呆　大鼠进行治疗，可明显改善大鼠搜索平台的潜伏期和跨越　平台的次数，改善大鼠学习记忆功能。　短暂性脑缺血或缺血后再灌注后引起的海马ＣＡ１区　迟发性神经元死亡（ＤＮＤ），是ＶａＤ常见的发生机制之一，　ＣＡ１区神经元的凋亡损伤可能是脑血管病后发生ＶａＤ的　病理基础．海马神经元的凋亡丢失和缺血坏死影响了神经　元突触的可塑性。影响了海马对信息的处理和传递，引起　脑缺血后记忆认知功能损害［６－９］。近年研究表明，中药不仅　可以保护神经细胞，提高神经元抵抗损伤的能力，并对　ＣＮＳ神经再生及神经功能重建具有促进作用。本实验中，　在缺糖缺氧培养条件下体外培养的海马神经元出现大量　的细胞凋亡，而预先加入补肾化痰祛瘀方血清进行处理　后。细胞凋亡率明显下降，说明补肾化痰祛瘀方对缺糖缺　氧培养条件诱导的海马神经元凋亡有拮抗作用，因此具有　神经保护作用，提高抵抗神经元损伤能力。　近来的体外研究及动物实验研究显示：Ｂｃｌ一２保护细　胞免于各种损伤，包括兴奋性氨基酸毒性、Ｃａ增多、脂质过　氧化、自由基损伤等。Ｂｅｌ一２表达的增加对脑缺血后损伤具　有保护作用。Ｂａｘ蛋白是促进细胞凋亡因子。促凋亡Ｂａｘ蛋　白在局灶和全脑缺血中对注定死亡的神经元出现表达增　多的现象．而在缺血损伤后恢复的神经元中的表达稳定。　在我们的动物实验中．ＶａＤ模型组大鼠ＣＡ１区Ｂａｘ高表　达，Ｂｃｌ一２低表达，凋亡细胞增多，证实了长期低灌注可使　海马神经元凋亡，影响认知和记忆。补肾化痰祛瘀方低剂　量组和高剂量组与模型组相比，均有Ｂｃｌ一２的高表达、Ｂａｘ　的低表达，凋亡细胞也明显减少。说明补肾化痰祛瘀方能　抑制海马神经元细胞的凋亡。达到保护神经元、改善ＶａＤ　大鼠学习记忆能力的效果，其机制与调节凋亡相关蛋白的　表达相关。　总之．补。肾化痰祛瘀方在拮抗ＶａＤ大鼠海马ＣＡ１区　神经元凋亡，与其在行为学上改善ＶａＤ大鼠学习记忆能力　一致。由此我们可以推断补肾化痰祛瘀方可以通过促进　Ｂｃｌ一２的表达，减少Ｂａｘ的表达，抑制海马神经元细胞的凋　亡，从而改善ＶａＤ大鼠学习记忆能力，两者是相辅相成，互　为因果。下一步的实验中我们将进一步研究补肾化痰祛瘀　方保护神经元的分子机制。　（下转第６页）　ＣＨＩＮＡ　ＭＯＤＥＲＮ　ＤＯＣＴＯＲ中国现代医生　３　・调查与实验研究・　２０１３年１１月第５１卷第３１期　剂量Ｈｊ药的老年患者、有精神病史或肾功能异常者，临床　【参考文献］　…刘鹰，仲华，朱蓓蓓，等．６种喹诺酮类抗菌药物不良反应的调查分　析『Ｊ１．中华医院感染学杂志，２００８，ｌ８（１１）：１６１３－１６１４．　表现以头昏、睡眠障碍、兴奋居多，故对于有脑部基础疾病　的患者应该尽量避免使用喹诺酮类　消化系统的不良反应以恶心、呕吐居多，这与喹诺酮　类药物分子结构中的喹酸对胃肠道的刺激有关．故应避免　空腹服用喹诺酮类药物Ｉ　，应在饭后半小时服用。通常消　化系统的ＡＤＲ与剂量有关，减少剂量或者停用药，ＡＤＲ可　得到缓解，重度患者应适当补充液体、电解质。　［２］渚慧，肖忠革，金剑，等．喹诺酮类药物不良反应、发生机制及其临　床处理Ⅲ．临床合理用药杂志，２００９，２（５）：８６—８７．　［３］张载福．病理生理学［Ｍ１．北京：人民卫生ｍ版社，１９９６：ｌＯ９一ｌ１２．　ｆ４］李强，朱雄，王尔华．喹诺酮类抗菌剂结构与不良反应之间的关￣－ＩＪ１．　药学进展，２００３，２７（１）：２９—３３．　综上所述，喹诺酮类药物ＡＤＲ的发生与药物性质、患　『５】钱之玉．药理学进展［Ｍ１．南京：东南大学　版社，２００５：４１１．　者的个体差异、临床使用等各方面因素有关，　此，在临床　［６】方静，周学琴．抗感染药物不良反应／事件报告相关因素分析及预　应用中应注意不良反应的观察，加强对特殊人群用药安全　防『Ｊ］．中国抗生素杂志，２０１２，２（３７）：１４１一ｌ４４．　性的关注．对于给药方式、药物相互作用、常见的不良反应　［７］张运琳．５２１例药物不良反应报告分析叽．海南医学院学报，２０１０，１６　类型等引起重视，在临床应用中应严格掌握适应证，疗程　（４）：５１５—５１７．　不宜过长。用药过程中，密切注意患者用药情况，发现不良　［８］陈红娟，何伟康．门诊药品不良反应报告分析【Ｊ】．占林医学，２０１０，　反应及时采取有效措施。临床药师通过分析、研究喹诺酮　３ｌ（２３）：３８５６—３８５７．　［９］王丽华．我院３７５例药品不良反应报告分析『Ｊ］．中国药房，２０１０，２１　类药物致ＡＤＲ的规律．通过多种形式，向临床医师及群众　（４６）：４３９５—４３９６．　提供安全用药方面的服务。提高用药的安全性。　（收稿日期：２０１３－０８—２８）　（上接第３页）　【参考文献】　元的保护作用［Ｊ１．中国病理生理杂志，２００３，１９（８）：１０９７—１０８３．　［６］Ｏｏｍｕｒａ　Ｙ，Ｈｏｒｉ　Ｎ，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｌｅｐｔｉｎ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ　ｌｅａｒｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｆ１］王吕铭，姚永杰，向静，等．人脐血单核细胞颈内动脉输注对血管　ｍｅｍｏｒｙ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ＣＡＩ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　性痴呆大鼠学习记忆的作用及在脑内的迁移分化Ⅲ．中国行为医　ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＣａＭＫ　ＩＩ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ１．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００６，　学科学，２００７，ｌ６（６）：４９３—４９６．　２７（１１）：２７３８—２７４９．　ｆ２】陈江瑛，闫振文，张付生，等．瘦素对血管性痴呆大鼠认知功能的　［７】Ｄｕｒａｋｏｇｌｕｇｉｌ　Ｍ，Ｉ￣ｉｎｇ　ＡＪ，Ｈａ￣ｅｙ　Ｊ．Ｌｅｐｔｉｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　改善保护作用ｌ　Ｊ１．中华行为医学和脑科学杂志，２０１０，１９（７）：６２１—　ＮＭＤＡ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ　ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ］Ｊ［．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｅｈｅｍ．　６２３．　２００５，９５（２）：３９６—４０５．　『３１杨发明，董联玲，曹娟，等．红景天对血管性痴呆大鼠行为学及海　马ＣＡ１区Ｂｃｌ及Ｂａｘ表达的影响『Ｊ］．中国中医药信息杂志，２００８，１５　【８］Ｒｕｓｓｏ　ＶＣ，Ｍｅｔａｘａｓ　Ｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　（６）：３９—４１．　ｌｅｐｔｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００４，１４５（９）：　Ｉ４１唐敬龙，高维娟，钱涛，等．补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马ＣＡｌ　４ｌ０３—４Ｉ】２．　区Ｕ［ｔＩ）及ＥＲＫ２与ＣａＭＫ１Ｉ　Ｂ　ｍＲＮＡ表达的影ｎ￣ｌＪ１．中风与神经疾　【９１　Ｚｈａｎｇ　Ｆ，Ｃｈｅｎ　Ｊ．Ｌｅｐｔｉｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ　ＣＡ１　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｇａｉｎｓｔ　病杂志，２０１３，３０（１）：ｌ１—１４．　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００８．１　Ｏ７（２）：５７８—５８７．　［５１　ｒ爱石，吴燕，吴丽颖，等．腺苷对体外培养的海马缺糖缺氧神经　（收稿日期：２０１３－０８—２９）　・编读往来・　医学名词术语　医学名词应使用全国科学技术名词审定委员会公布的名词。尚未通过审定的学科名词，可选用最新版《医学主　题词表（ＭＥＳＨ）））、《医学主题词注释字顺表》、《中医药主题词表》中的主题词。尚未有通用译名的名词术语，于正文　内第一次出现时应注明原词或注释。中西药名以最新版《中华人民共和国药典》和中国药典委员会编写的《中国药　品通用名称》为准，不应使用商品名。中医名词术语按ＧＷＴ１６７５１．１—１９９７￣中医临床诊疗术语疾病部分、证候部分、　治法部分》执行，经络针灸学名词术语按ＧＢ／Ｔ　１６７５１．２—１９９７（￣穴部位》和ＧＢ／Ｔ１６７５１．３—１９９７（耳穴名称与部位》　执行。中药应采用正名，药典未收入者应附注拉丁文。　：　６　中国现代医生ＣＨｌＮＡ　Ｍ０ＤＥＲＮ　Ｄ０ＣＴＯＲ