聚酰胺柱层析法分离回心草总黄酮的研究

・药物分析・　聚酰胺柱层析法分离回心草总黄酮的研究　蔡　鹰　一，陆晓和’，魏群利　（１．南京军区南京总医院，江苏南京２１０００２；２．中国人民解放军第４５４医院，江苏南京　２１０００２）　摘要　目的：确定聚酰胺柱层析法分离回心草总黄酮的条件。方法：对聚酰胺用量、乙醇洗脱浓度、洗脱速度　等方面进行考察。结果：干法上样，聚酰胺用量以药材：聚酰胺＝１：１为佳，以５０％的乙醇为洗脱溶剂，２　倍柱体积／ｈ为最佳的洗脱速率。结论：聚酰胺可较好地用于回心草总黄酮的分离富集。　关键词回心草；聚酰胺；总黄酮　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６一Ｏ１１１（２００９）Ｏｌ一００５８—０３　中图分类号：Ｒ２８４　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｒｈｏｄｏｂｒｙｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ　ｂｙ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｔａｐｈｙ　ＣＡＩ　Ｙｉｎｇ　，ＬＵ　Ｘｉａｏ—ｈｅ　，ＷＥＩ　Ｑｕｎ—Ｌｉ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｎｏ．４５４　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ＰＬＡ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００２，Ｃｈｉｎａ）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｓｅｌｅｃｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｆｏｒ　ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａ—　ｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｒｈｏｄｏｂｒｙｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ（Ｓｃｈｗａｅｇｒ．）Ｐａｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ，ｔｈｅ　ｅｌｕｔｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｌｕｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｔ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｈｅｒｂ　ａｍｏｕｎｔ：ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｗａｓ　１：１，ａｎｄ　５０％ｅｔｈｎｏａｌ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｓｕｔｉａｂｌｅ　ｅｌｕｔｉｎｇ　ｒｅａ—　ｇｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｅｌｕｅｎｔ　ｗａｓ　２　ｔｉｍｅｓ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｃｏｌｕｎｍ／ｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ｉｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｒｈｏｄｏｂｒｙｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ（Ｓｃｈｗａｅｇｒ．）Ｐａｒ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　Ｒｈｏｄｏｂ０　ｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ（Ｓｃｈｗａｅｇｒ．）Ｐａｒ．；ｐｏｌｙａｍｉｄｅ；ｔｏｔａｌ　ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ　回心草为真藓科植物大叶藓Ｒｈｏｄｏｂｒｙｕｍ　ｒｏｓｅ—　ｕｍ（Ｈｅｄｗ．）Ｌｉｍｐｒ．以及暖地大叶藓Ｒｈｏｄｏｂｒｙｕｍ　糖，醇提液含大量叶绿素，对成分鉴定和测量造成　很大困难，通过聚酰胺柱处理后，盐酸一镁粉反应明　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ（Ｓｃｈｗａｅｇｒ．）Ｐａｒ．的干燥或新鲜全草，分　显，说明黄酮类成分得到富集。目前，聚酰胺已广　布于东北、华北、华东和西南地区，其中云南省为主　要产地，是我国云南省少数民族共用的传统草药，傈　僳族、彝族、景颇族、纳西族等均有用药历史。《中　药大辞典》称具有清热明目，养心安神，镇咳祛痰的　泛应用于中药有效部位或有效成分的分离，且对　黄酮类、酚类、醌类等物质的分离远比其他方法优　越，具有可逆、分离效果高等特点。为了富集回心　草的黄酮类成分，我们采用聚酰胺为载体进行分　离研究，考察了聚酰胺分离纯化回心草总黄酮的　条件，以期为回心草的进一步开发和利用提供参　考　功效，主治心悸怔忡，神经衰弱，目赤肿痛等。本院　通过多年的实验研究，发现回心草对动脉硬化有较　好的治疗作用。　由于回心草主要在民间作草药使用，因而对　回心草化学成分的研究报道不多。戴畅　从其中　分离得到２６个化合物，鉴定了其中２３个化合物。　其中含黄酮类化合物：芹菜素，槲皮素等。黄酮类　成分对心血管疾病有显著的药理活性。通过化学　成分预试验我们发现回心草的水提液含大量多　１仪器与材料　ＵＶ一１７００紫外分光光度计（Ｅ１本岛津公司）；　芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号　００８０－９７０５）；聚酰胺［中同医药集团上海化学试剂　公司产品（５０～６０目）］；回心草药材（亳州中药材　公司），经南京中医药大学中药鉴定教研室岳魏鉴　作者简介：蔡鹰（１９６７一），女，副主任药师，在职博士后．Ｔｅｌ：（０２５）　８０８６３１６９，Ｅ—ｍａｉｌ：ｃａｉｙｉｎｇ１９６７＠１２６．ｃｏｎ．　定，为真藓科植物暖地大叶藓Ｒｈｏｄｏｂｒｙｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ　（Ｓｃｈｗａｅｇｒ．）Ｐａｒ．的干燥全草，试剂亚硝酸钠、硝酸　铝、氢氧化钠、甲醇均为分析纯。　通讯作者：陆晓和．Ｔｅｌ：（０２５）８０８６０１６０，Ｅ—ｍａｉｌ：Ｌｕｘｉａｏｈｅ＠ｍｅｄｍａｉｌ．　ｃｏｒｎ．Ｃｎ．　药学实践杂志２００９年第２７卷第１期　２方法与结果　２．１　标准曲线的绘制　精密称取在１０５　十燥　结果见表１。　表１聚酰胺用量的考察　聚酰胺用量　ｌ：１（共１２ｇ）　ｌ：２（共１８ｇ）　１：３（共２４ｇ）　至恒重的芦丁对照品１１１．５　ｍｇ，置５０　ｍＬ量瓶中，　洗脱的总黄酮量（ｍｇ）　５２．１２　６４．２６　６０．３４　加甲醇３０　ｍＬ，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇　稀释至刻度，摇匀。精密吸取５　ｍＬ，置５０　ｍＬ量瓶　中，加水稀释至刻度，摇匀，即得芦丁标准溶液　（０．２２３　ｍｇ／ｍＬ）。精密吸取芦丁标准溶液０．０、　１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０　ｍＬ，分别置２５　ｍＬ量　从表１可以看出，拌药的聚酰胺：未拌药的聚　酰胺＝１：２时，洗脱的总黄酮量最大。　瓶中，各加水至６　ｍＬ，加５％亚硝酸钠溶液１　ｍＬ，　使混匀，放置６　ｒａｉｎ，加１０％硝酸铝溶液１　ｍＬ，摇　匀，放置６　ｒａｉｎ，加５％氢氧化钠试液１０　ｍＬ，再加水　至刻度，摇匀，放置１５　ｒａｉｎ，以第１管作为空白对　照，在５００　ｎｌｎ处测吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度　为横坐标，绘制标准曲线。求得回归方程：Ａ＝　８．０７１　７Ｃ一０．０１ｌ　３，ｒ＝０．９９９　１，对照品在０．００８　９２～０．０５３　５２　ｍｙ，／ｍＬ呈良好线性关系。　２．２对照品的稳定性试验　照“２．１”项下方法，对　照品溶液经显色后，于不同时间在５００　Ｆｌｍ处测吸收　度。实验结果表明，对照品溶液在显色后１２０　ｒａｉｎ　内吸收度稳定。因此，测定吸收度应在１２０　ｒａｉｎ内　完成。　２．３样品中总黄酮的含量测定　各洗脱液蒸干后　加５０％甲醇适量溶解，置２５　ｍＬ容量瓶中，以下按　照标准曲线制备方法进行操作，测定吸光度，由得　到的回归方程计算样品中总黄酮的含量。　２．４总黄酮的分离研究　．４　２．４．１聚酰胺的预处理　因聚酰胺树脂残留有　甲苯等有机残留物，有较强的毒性，对产品有不良　影响，因此使用前应作预处理：用９５％乙醇浸泡聚　酰胺树脂２４　ｈ，湿法装柱，用９５％乙醇淋洗至洗脱　液与蒸馏水混合（１：５）不呈白色浑浊，再用蒸馏　水洗至无醇昧，然后用３倍柱体积０．５　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣＩ、　ＮａＯＨ溶液洗脱，加入蒸馏水浸泡树脂１　ｈ后，水　洗至中性，用３倍柱体积０．５　ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣＬ溶液洗　脱，加入蒸馏水浸泡树脂１　ｈ后，水洗至中性，备　用。　２．４．２　聚酰胺用量的考察　干法上样，１　８ｇ回心　草药材６０％醇提物浓缩至稠膏状，加６０％乙醇适　量，按药材生药量：聚酰胺重量＝３：１充分混合，　置烘箱中８０℃烘干，备用。未加药的聚酰胺湿法　装柱，装于　２．５　ｃｍ的玻璃柱，水排至液面与聚　酰胺平齐，分别按拌药的聚酰胺：未拌药的聚酰胺　＝ｌ：１、１：２、１：３，上样，先以水洗，洗出液无色，　弃去水洗液；再用５０％的乙醇５００　ｍＬ洗脱，洗脱　物测总黄酮含量，以考察其合适的聚酰胺用量。　２．４．３总黄酮在聚酰胺柱上的洗脱曲线　１８　ｇ药　材６０％醇提液浓缩后用６　ｇ聚酰胺搅拌均匀，烘干，　备用。１２　ｇ未加药的聚酰胺装于（Ｐ２．５　ｃｍ的玻璃　柱，湿法装柱，水排至液面与聚酰胺平齐，加人拌上　药的聚酰胺，先以水洗，洗出液无色（５００　ｍＬ水），弃　去水洗液；再用２０、３０、４０、５０、６０％不同浓度的乙醇　洗脱，以考察其对总黄酮的洗脱率。　表２不同浓度乙醇对回心草中总黄酮洗脱能力的考察　从表２可以看出，２０％、３０％、４０％乙醇洗脱的　总黄酮量相近，至５０％时洗脱量接近翻一倍，至　６０％时黄酮洗脱量极少，洗脱物几乎全为绿色色素，　单独用５０％乙醇洗脱总黄酮量与分别从２０～５０％　乙醇每一步洗脱总黄酮量的总和接近，所以认为　５０％乙醇是合适的洗脱溶剂。　２．４．４洗脱速率的确定　照２．４．３方法，５０％乙　醇洗脱，考察不同洗脱速率对结果的影响。结果见　表３　表３不同洗脱速度对回心草中总黄酮量的影响　洗脱速度　洗脱的总黄酮量（ｍｇ）　１倍柱体积／ｈ　６２．３３　２倍柱体积／ｈ　５９．２４　３倍柱体积／ｈ　４２．３１　从表３可以看出，洗脱速率对结果有一定影响，　太慢耗时太长，太快又洗脱不完全，２倍柱体积／ｈ是　比较适宜的洗脱速度。　２．４．５转移率的考察按２．３样品中总黄酮的含　Ｊｏｕｍａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　Ｖｏ１．２７　２００９　Ｎｏ．１　量测定方法测定１８　ｇ药材总黄酮量为７７．１２　ｍｇ，比　较２．４．３表２结果，１８　ｇ药材单独用５０％乙醇洗脱　得６５．５２　ｍｇ总黄酮，转移率达８４．９５％，基本符合　要求。　２．５　回心草总黄酮的制备　１８　ｇ回心草药材　３讨论　３．１　由于芦丁和黄酮类化合物都是以２一苯基色原　酮为母核的结构，具有相同的吸光度测试性质，均　在５００　ｎｍ附近有最大吸收，所以采用芦丁为对照　品测定回心草总黄酮的含量。　３．２用干法上样是为了减少水溶性差的黄酮类成　分的丢失，传统的上样都是取样品水溶液的上清液　上样，因为本样品是６０％醇提物，该法势必造成水　溶性差的黄酮类成分的丢失。干法上样保留了这部　６０％醇提物浓缩至稠膏状，加６０％乙醇适量，按药　材生药量：聚酰胺重量＝３：１充分混合，置烘箱　中８０℃烘干，备用。未加药的聚酰胺湿法装柱，　水排至液面与聚酰胺平齐，按拌药的聚酰胺：未　拌药的聚酰胺＝１：２，上样，先以水洗，洗出液无　色，弃去水洗液；再用５０％的乙醇５００　ｍＬ洗脱，　分成分，使结果更准确。　３．３采用６０％乙醇作为药材提取溶剂，是药效跟　踪的结果。　参考文献：　［１］戴畅．藓类植物回心草的化学成分和生物活性研究［Ｄ］．　于６０℃减压回收乙醇，至稠膏状，于６０℃减压干　燥，得回心草总黄酮。测定其中的总黄酮含量，结　果见表４。　表４　回心草提取物中的总黄酮含量测定结果　北京：解放军总医院军医进修学院，２００６．　［２］中华药典２００５版一部［Ｓ］．２００５，２４６．　［３］　白云娥，漆小梅，赵华，等．聚酰胺分离金莲花总黄酮［Ｊ］．　中国医院药学杂志，２００６，２６（５）：５１２．　［４］　黄优生，谢明勇，张中伟，等．山楂总黄酮的测定［Ｊ］．南昌　大学学报（理科版），２００６，３０（５），４７５．　从表４可以看出，上聚酰胺柱后５０％乙醇洗脱　物总黄酮含量能达到３０％左右，说明聚酰胺对回心　［５］王化田，龚钢明．大孔树脂纯化红景天甙工艺的研究［Ｊ］．食　品科学，２００７，２８（２）：ｌ１７．　收稿日期：２００８－０６—１８　草中的总黄酮有较好的富集作用。　（上接第５３页）　状况进行系统调研的基础上，修订医疗机构处方集，　参考文献：　［１］　ＪＡＭＥＳ　Ｍ，Ｈｏｆｆｍａｎ．Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｒｕｇ　ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｓ－２００４　［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｙｓｔ　Ｐｈａｒｍ，２００４，６１（１）：１４５．　并对医院的药物使用体系进行规划和调整，以确保　医疗机构药房的正常运转。　３．４药品价格问题一直是各国关注的焦点，也是公　众急切想要解决的问题。美国医药市场虽然一直处　［２］Ｓｈａｈ　ＮＤ，Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ　ＬＣ，Ｓａｎｔｅｌｌ　ＪＰ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｒｕｇ　ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｓ－２００２［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｙｓｔ　Ｐｈａｒｍ，２００２，５９（２）：　１３１．　于世界的前列，但由于人口趋于老龄化和疾病谱扩　大等客观问题的存在，造成其卫生机构支出趋势逐　年上涨。美国政府相应采取了健全立法、加强监管、　［３］　ＪＡＭＥＳ　Ｍ，Ｈｏｆｆｍａｎ．Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｒｕｇ　ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｓ－２００５　［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｙｓｔ　Ｐｈａｒｍ，２００５，６２（１）：１４９．　［４］　ＪＡＭＥＳ　Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎ．Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｒｕｇ　ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｓ－２００６　［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｙｓｔ　Ｐｈａｒｍ，２００６，６３（１）：１２３．　［５］　ＪＡＭＥＳ　Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎ．Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｒｕｇ　ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｓ－２００７　扩大医疗保险覆盖面、缩短新药审查时间等一系列　措施，以从宏观上控制药品费用的增长。我国药品　价格问题同样备受政府和社会关注，近几年来全国　各省市相继采取了多种形式的药品集中招标采购模　式以降低药品价格，但收效不明显。通过本文的分　［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｈｅｌａｔｈ　Ｓｙｓｔ　Ｐｈａｒｍ，２００７，６４（２）：２９８．　［６］　张涛．全球药市销售创新高［Ｎ］．医药经济报，２００８，１０－２７　（４）．　［７］　ＪＡＭＥＳ　Ｍ．Ｈｏｆｍａｎ．Ｐ叫ｅｃｔｉｎｇ　ｆｕｔｕｒｅ　ｄｒｕｇ　ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｓ－２００８　［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｙｓｔ　Ｐｈａｒｍ．２００８，６５（１）：２３４．　［８］杨艳，陈盛新，纪晖．美国卫生机构药品支出趋势与影响　析，美国对药品费用增长的控制措施更多地从增长　源头着手，如缩短新药审评时间来降低开发成本，健　全立法和扩大医保覆盖面来分摊增长的费用等方　法，对于我国如何有效控制不断增长的药品费用具　因素分析［Ｊ］．药学实践杂志，２００４，２２（４）：２０５．　［９］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｎｅｗｓ／２７６４５０．ｓｈｔｍｌ华文生技　网．　有重要的借鉴意义。　收稿日期：２００９－０１－０４