猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002

猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002

1. 3. 1 剪切 猪妊娠 35 d， 剖腹手术取出子宫， 用 75% 的酒精浸泡消 毒，无 菌 取 出 胎 儿，用 含 双 抗 的 PBS ( 137mmol /L NaCl 2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L Na2HPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl2 0. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗 2 遍， 放入含双抗的 PBS 中，分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无 Ca 2+、Mg2+，含有双抗的 PBS 缓冲液洗涤3

次, 洗至无色, 备用。将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、 Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 将剩余的部分放入到100mm的平皿中，然后用剪子将胚胎剪切成 2～3 mm 小块, 将碎块转移到50ml离心管中。

1. 3. 2 消化 向放有组织块的离心管中加入二分之一离心管体积的0.25% Trypsin-0.04%EDTA 消化液（胰蛋白酶常用浓度为0.25%，PH为8.0。也有用胶原酶的，因为此酶消化温和，但是价格高，如果用胶原酶则为胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic，小鼠多用10ml离心管，因此加入胰酶消化液5ml即可） 然后在室温下轻轻吹打组织块(或者， 在 37℃水浴摇床内消化)。室温消化15～20 min 左右（如果在37摄氏度最好在5min内消化完）。可以边消化边吹打组织块, 也可以每隔5 min 吹打一次。 消化结束后, 加入等体积的终止液10% 胎牛血清的 DMEM 培养液(即吸出来细胞上层液如果多则放于到5ml离心管中，如果少则放于1.5ml离心管中）,并轻轻吹打。

1. 3. 3 离心、接种和培养 800 r·min 离心5 min, 弃上清液, 然后加入5ml（或1ml) 的含20%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养基, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 按常规方法进行细胞计数（1ml离心沉淀的细胞数=5个中方格中细胞个数 X 5 X10 X1000 X稀释倍数，此时的计算值为体细胞的密度即 个/ml. 大约徘徊在1-3 x 106个/ml）。 以2×105个细胞/ mL(此值因为离心后又加入5ml,即稀释倍数为5.） 的浓度接种于25 mL 预先2小时涂有0.1%明胶（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）的培养瓶中(根据具体情况加入4-5ml培养基，但是加入的培养基要求细胞的最终浓度为2 ×105个/ml)(或者转入到10mm平皿中，在38.5℃，5%CO2和饱和湿度培养）于39℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养。12小时候观察细胞贴壁生长状况，（原代培养 24 h 后， 可见细胞贴壁生长，来源：借助慢病毒将 EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）一般在第二天换液，随后隔天换液，逐天观察，待细胞将80%-90%培养瓶铺满后即形成细胞单层，开始进行传代。一般消化 1 个猪胎儿获得的细胞可接种 2 个 50 ml的培养瓶。

如下图为传代培养第一代的西藏小型猪胎儿成纤维细胞图：

（来源：借助慢病毒将 EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）

1.3.4传代培养及纯化（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）

清洗：先吸出旧培养液，再用无钙，镁离子的PBS缓冲液冲洗胚胎成纤维细胞3遍，去除血清和脱落的组织块及死细胞的PBS。

消化：加入0.1%胰酶消化液（或者1ml0.25%胰酶+1mmol/lEDTA 4Na)约2ml作用1-3min,(37℃培养箱中消化约5min),倒置显微镜下观察细胞质收缩变圆，（然后立即加入2ml消化终止液（DMEM+10%FBS)终止消化，然后仔细吹打细胞悬液，将细胞悬液收集至15ml离心管中，700r/min离心10min,弃去上清液后，再用培养液DMEM+20%FBS重悬浮细胞，并轻轻吹打使细胞分散均匀，传入新的培养皿中继续培养。 本内容来源：借助慢病毒将 EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）即可倒掉消化液，继续作用约1分钟。

分瓶：轻敲瓶底使成纤维细胞脱落瓶壁，加入STO培养液（STO培养液的配置：FCS (fetal calf serum)10 ml; L-glutamine 1 ml; No-AA 1 ml;β-mercaptoethanol 100μl;DMEM 88 ml。）终止消化。充分吹打使细胞团成为单细胞悬液，以1×105个/ml的密度传入25ml（或50ml)传入新鲜培养瓶中继续培养，一般一瓶细胞可以传2-3瓶。

1.3.4细胞的冻存和复苏（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研

究）

消化：猪胚胎成纤维细胞培养2代后，选择长至80~90%汇合生长的旺盛的细胞，

弃

去培养瓶中的原DMEM培养液，用无Ca，Mg PBS缓冲液洗3次，加入胰酶消化液，作用约1~3分钟，弃去胰酶消化液，再稍微作用约1分钟，直到轻敲瓶底细胞层出现断裂，加入培养液终止消化液的作用。

计数：用红细胞计数板计算冻存细胞总数。

收集细胞：用吸管将其吹打成单细胞悬浮液并将其转移到离心管，1000rpm/min离心

10分钟。

分装：弃去上清液，用冻存液（含10%DMSO的培养液）约1 ml收集细胞，分装于冻存管中。一般一个50ml培养瓶的细胞可以冷冻两管。

冷冻过程：将冷冻管中的细胞在4℃冰箱冷冻半个小时后在-20℃冰箱冷冻2~3小时，然后转入-80℃超低温冰箱中过夜保存，第二天转入液氮中长期保存。细胞悬液的冷冻速度对冷冻效果的影响很大，多数细胞以每分钟下降1℃的速度降至﹣20℃，冻结均可获得满意效果。

解冻：从液氮中取出冻存管，立即放入40℃温水中不停搅动，令其快速解冻，时间控制在一分钟内。

接种细胞：将细胞悬液移入离心管中，加入等体积STO培养液，立即放入离心机中，1000 rpm/min离心10分钟，弃去上清液，加入新鲜培养液，充分吹打接种到预先2小

时涂有明胶的培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。

对状态良好的细胞要及时冻存、编号。低代细胞由于避免了长期体外传代引起的基因不稳定和细胞表型变化，可保持原细胞的特征。但当细胞离开活体开始体外培养后，它的各种生物学特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的增加和体外培养条件的变化而不断有新的变化。因此，及时冻存低代细胞是很必要的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融。细胞冻存效果的好坏还与细胞在冻存液中的分散程度密切相关，细胞分散得越好，冻存效果越好，分散细胞时以冻存液中肉眼看不见细胞沉淀为标准。胎儿成纤维细胞贴壁前呈圆形,一般2~ 3 h 即出现贴壁现象, 12 h 后即可增殖。细胞生长时呈放射状、 火焰状或旋涡状走行, 生长旺盛的细胞之间连接紧密,一般4~ 5 d即可形成细胞单层( 达到 70%~ 80%细胞汇合) 。倒置相差显微镜下观察,可见细胞透明,细胞颗粒少, 大多数细胞胞质形成 2 个突起, 呈长梭形, 一般胞体的中心部,即核存在的位置稍稍隆起, 立体感强。

1.3.5细胞存活率计算

在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，如果酶消化制备的细胞悬液中细胞活力检测等。常用活体染料台盼兰（Trypan blue）对细胞进行染色。

染色：用微量加样器吸取0.5 ml细胞悬液于一小试管中（无菌操作），再加入0.5 ml 0.4%台盼兰染液，用吸管轻轻打匀，染色1～2分钟。

计数：取一滴染色后的细胞悬液滴入计数板，计数每毫升细胞悬液中死亡细胞数（被染色的细胞）。由于在细胞悬液中加了等量的台盼兰染液，所以计数出的细胞数要再乘以2（稀释倍数）才是正确的死细胞数。

细胞存活率计算：细胞存活率＝（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100%

1.3.6胎儿成纤维细胞生长曲线的绘制（猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）

（1）细胞悬液制备：选择生长状态良好的成纤维细胞，用常规消化法消化细胞，制成细胞悬液，红细胞计数板计数。

（2）接种：24孔培养板内分别接种1×104个细胞/ml（细胞分散程度对结果影响很大，尽量制成单细胞悬液），于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。

（3）计数检测：从接种时间算起，每一天对3个孔中的细胞进行计数，算出

平均值。

（4）绘图：以培养时间（d）为横坐标、细胞密度为纵坐标，作图。

常规的细胞操作是包括分瓶的传代（passage），每次传代以1：3到1：5的比例分瓶，具体的传代间隔时间以细胞的生长周期来决定。同时转染时机的把握也很重要。一般，细胞铺满瓶底50%～60%为宜，注意在转染时培养瓶内细胞不能长满。血清中的载脂蛋白与脂质体的相互作用会导致脂肪酸链运动的自由度降低，双分子层堆积特性改变和脂质从脂质体转移到载脂蛋白上，使脂质体膜的通透性增加，最终破裂。其次血清白蛋白、抗磷脂抗体和可溶性脂交换蛋白也可引起脂质体膜的不稳定。DNA-脂质体复合物同细胞通常是在无血清环境下作用的。

1.3.6pEGFP-N3转染猪胎儿成纤维细胞的研究

（1）材料： G418（Sigma）、Fugene-6（Roche）、pEGFP-N3（Clontech，此公司的载体质粒）、EcoO1094与超纯质粒提取试剂盒（天为时代，此公司的限制性内切酶和质粒提取试剂盒）

（pEGFP-N3载体的简介：作为为真核细胞表达载体。）

pEGFP-N3 - 特点

pEGFP-N3

①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；

②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达； ③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；

④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。

这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。

pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。pEGFP-N3 - 相关知识

pEGFP-N3

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria， 是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFPGFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。

与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点：

①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；

②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；

③蛋白本身性质稳定；

④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；

⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。

EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了

其报告基因的敏感度。EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光。

（2）pEGFP-N3质粒DNA的提取：

将菌液培养12-24小时，用试剂盒提取并纯化质粒DNA，用EcoO1094酶切质

粒DNA使pEGFP-N3线性化，紫外分光光度计计算DNA纯度和浓度，用于转染。

（3）不同基因剂量对GFP转染阳性率的影响的研究：

细胞转染: 接种1×105~2×105个PEF细胞到12孔培养板中，待细胞长到50%-60%汇合。在灭菌eppendorf管中准备下列DNA和脂质体溶液：

A:稀释1.5μl Fugene-6试剂（标准计量）于100μl脂质体稀释液中，室温放置30~45min。B：分别稀释0.5、0.8、1.0、1.2μg DNA于100μl PBS液混合两种溶液。室温放置15-30min。然后将A和B两溶液混合，待Fugene-6脂质体与DNA形成复合物，用PBS液清洗细胞两次，加0.8ml脂质体稀释液稀释Fugene-6-DNA复合物，混匀后加入待转染的细胞中，加入1ml DMEM培养液（无G418、血清）37℃温育，5-6小时后，吸出转染液，用PBS液轻洗细胞两次，加入3ml正常的生长培养液(完全培养液），37℃、饱和湿度、5%CO2继续培养18-24h后换液（完全培养基）。48小时后，用荧光显微镜观察。

附加贴壁细胞的转染另外一种操作（来自：《动物细胞培养基本技术指南》)

观察计数：培养48小时后，将转染细胞放在激发波长为488nm的荧光显微镜下观察

GFP蛋白表达，以放大200倍的显微镜视野为标准，计5个显微镜视野表达绿色荧光的细胞数，算出阳性率，以此评价转染效率。(以下来源于：双标记选择载体转染牛胎儿成纤维细胞方法的建立）在荧光显微镜下观察上述方法所得细胞克隆的发光情况，用记号笔圈住分散良好(远离其他克隆)且细胞数量多的荧光克隆;吸除培养液，用无钙镁PBS漂洗细胞两次，在高倍解剖镜下，将30一50μl 0.25%胰蛋白酶消化液滴加在标记好的细胞克隆上，待克隆的大多数细胞收缩脱壁后，不等细胞悬浮，快速吸取细胞克隆，但注意不要吸入附近其他克隆的细胞;转移细胞到加有500μl培养液的4孔板中，吹打分散细胞团块;挑出的克隆继续培养，降低G418浓度至300μg/mL维持筛选;待克隆细胞数量扩大后或汇合后，将一部分细胞转移到35mm培养皿中继续扩大培养，另一部分用于转基因检测，其他扩大后的细胞尽早冷冻.

（4）脂质体量对转染阳性率的影响的研究

细胞转染：接种1×105-2×105个PEF细胞到12孔培养板中，待细胞长到50%-60%汇合。在灭菌eppendorf管中准备下列溶剂。A:分别稀释1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μFugene-6试剂于100μl脂质体稀释液中，室温放置30-45min。B：稀释1.0μg DNA于100μl PBS液混合两种溶液。室温放置10-15min。Fugene-6与DNA形成复合物，用PBS液清洗细胞两次，加0.8ml PBS液稀释Fugene-6-DNA复合物。混匀后加入待转染细胞中，再补加1ml DMEM培养液（无G418、血清），37℃温育，5小时后，吸出转染液，用PBS液轻洗细胞两次，加入正常的生长培养液，37℃、饱和湿度、5%CO2继续培养。48小时后，用倒置荧光显微镜观察

细胞筛选：细胞转染完毕后，吸出转染液，用PBS液轻洗细胞两次，常规方法消化传代，一般以1：5或更高的比例传代，加入STO培养液，37℃、饱和湿度、5%CO2继续培养24h。然后将培养液倒掉，用含有G418的培养液继续培养7－15天，G418浓度分

别为100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml、800μg/ml。

1.4 脂质体转染及药物筛选细胞

（1）转染前一天，接种细胞于24 孔板，使细胞在转染时达到 50%～80%汇合。接种和转染过程中避免有抗生素。

（2）预先混合 DNA 和 PlusTM试剂：稀释 0.4 µg DNA于25 µl不含血清的D-MEM/F-12 培养液中，再加 4 µl PlusTM试剂到稀释的 DNA 中，混匀，室温孵育15 min。

（3）稀释1 µl LipofentamineTM2000到25 µl不含血清的 D-MEM/F-12 培养液中，混匀。

（4）把第 2 步形成的 DNA-PlusTM 复合物与第 3步稀释的 LipofentamineTM2000 混合，混匀，室温孵育15 min。

（5）在复合物形成的过程中，用0.2 ml 不含血清的 D-MEM/F-12 培养液取代细胞

上的原有培养液。

（6） 加第4步形成的DNA-PlusTMLipofentamineTM2000 复合物到含有新鲜培养液的含有细胞的孔中，把复合物轻轻的混匀到培养液中，在 37℃，5%的 CO2培养箱中，孵育 3 h。

（7）孵育 3 h 后，用新鲜完全的培养液代替含有复合物的培养液。

（8）转染48 h 后开始药物筛选，并设未转染细胞作对照。在细胞培养液中加入 G418 至200 µg·ml-1进行正筛选，隔天换 1 次液，1 周后，改换加 2 µmol·L-1GANC 的细胞培养液，进行负筛选，隔天换培养液，筛选 1 周。

1.5 抗性细胞PCR 检测

用 Easy DNA kit提取抗性细胞基因组，严格按照产品说明进行操作。 抗性细胞的 PCR鉴定引物的上游引物 P1位于Neo 下游，下游引物P2 位于同源短臂外测的基因组DNA 上，扩增片段为1 050 bp。引物序列为：P1：5′-ATA GCC TGA AGA ACG AGA-3′；P2：5′-AAA TGC ACC TGA AGA AAG-3′。反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 90 s（35个循环）；72℃ 8 min；4℃ 30 min。同时设未转染细胞为阴性对照。

1.6 未转染细胞内及转染后抗性细胞内 RNA 的提取

PBS 清洗细胞 3 次，用 0.25%胰蛋白酶-0.04% EDTA 消化细胞，收集细胞于 1.5 ml 离心管内；1 000 r/min 离心6 min，弃上清；4℃预冷的PBS 清洗细胞；1 000 r/min

离心 6 min，弃上清；4℃预冷的 PBS 清洗细胞；1 000 r/min 离心6 min，弃上清；加 1 ml Trizol，用移液器混匀，室温静置5 min；加 0.2 ml 氯仿振荡15 s，室温静置 3 min；4℃，12 000 r/min 离心15 min；转移上清液到新灭菌的 1.5 ml 离心管内；加 0.5 ml异丙醇， 室温静置 10 min； 4℃， 12 000 r/min 离心10 min；弃上清， 用75%乙醇清洗； 4℃， 7 500 r/min离心5 min；

干燥沉淀；DEPC灭活水溶解沉淀，部分－70℃保存，部分进行变性胶电泳，检查 RNA 是否降解，用紫外分光光度计法定量并测纯度。

实验设计成分：

原代细胞生长特点：猪胎儿成纤维的原代培养组织在接种后6－12h即可贴壁，此时应及时换液，否则将影响细胞的生长延伸。换液后一天细胞呈梭形，为典型的成纤维细胞形态，细胞保质丰满，核仁清晰可见。因为胚胎组织细胞种类较多，虽然除去头、尾、四肢、内脏等，但仍然可见到上皮样细胞（呈星型或三角状）、神经细胞、游走型细胞。这些杂细胞会在反复传代过程中被逐渐淘汰掉。随着培养时间的延长，整个细胞群体呈现火焰状和旋涡状，大概在3-5天形成细胞单层。

传代细胞生长特点：成纤维细胞在传代后10min既有部分细胞贴壁，此时细胞密度较小，原来圆形细胞伸出伪足，细胞形状不规则，当细胞生长汇合后，细胞之间的间隔消失，细胞间相互挤压，呈长梭形，仅梭形的两端有伪足。随着细胞密度增大，细胞停止分裂和生长（即接触抑制）。在细胞接触抑制之前，可见到有一些圆亮细胞，为正处于分裂期（M期）的细胞，还有刚刚完成分裂的两个圆细胞紧密排列在一处，还可观察到正在进行分裂的细胞连在一起。在一个视野内，分裂期细胞的多少可直接表明细胞的状态和质量（约3%左右）。本实验胎儿成纤维细胞最高可传到26代，此后细胞将逐渐老化，不再分裂增殖。

细胞生长曲线绘制：细胞培养中传代时机的把握很重要，为了准确掌握PEF的传代周期，作出F2、F5、F10细胞的生长曲线见图2.1；PEF在第1－2天处于生长滞缓期，该时期为细胞的适应阶段，是细胞在传代培养过程中引起的细胞损伤后的修复时期。第3－5天为对数生长期，倍增时间为3天。此后，细胞进入生长平台期，细胞产生接触抑制，细胞生长缓慢或停止生长，部分细胞甚至死亡。

不同浓度的酶对猪胚胎成纤维细胞建系的影响： 随着胰酶浓度的增加，死细胞率也将逐渐提高，0.075%胰酶处理的死细胞率显著低于高浓度组，传代后72h观察细胞的生长情况可见0.1％胰酶处理的细胞生长良好，细胞总数最高。

不同浓度的胰酶对传代细胞的影响

Effect of trypsin concentration on passage of PEF（X±S）

胰酶浓度（%） 0.075% 0.1% 0.125% 0.15% 0.2%

死细胞率（%）2.77±0.23** 4.03±0.41 4.25±0.39 4.70±0.41 5.43±0.32*

72 h细胞 2.70±0.32 3.50±0.29** 2.38±0.25 2.15±0.26 1.75±0.21*

生长情况（105）

注：表中有*上标的差异显著（p<0.05）,有**上标的差异极显著（p<0.01）.

*The mean difference is significant at the 0.05 level.**The mean difference is significant at the 0.01 level.

Effect of digestion time on passage of PEF（平均值±S ）

血清浓度（%） 5% 10% 15% 20%

72 h细胞生长情况（105）2.61±0.40* 3.38±0.31 3.69±0.34 3.83±0.40

注：表中有*上标的差异显著（p<0.05）.

*The mean difference is significant at the 0.05 level.

对比观察生长细胞的形态如细胞游离期的长短，细胞贴壁时间长短，细胞进入增殖期时间，形成单层细胞所用的时间，细胞收获量（1个猪胎儿接种量即可以接种到几个25ml的培养瓶）；

细胞培养状况如细胞内颗粒的多少，细胞的透明度，细胞形态的界限明显程度。最好是细胞内颗粒少，透明度好，立体感强，界限明显即可以传代。，刚接种的细胞呈圆形，当细胞刚贴壁时呈短梭形或多角形的扁平态， 排列不规则, 颜色较深,细胞膜明显, 不断增殖后的细胞, 成纤维细胞形成以长梭形或不规则多角形为主；上皮细胞呈星形或三角形。

此实验考虑点：当进行热消化放入培养箱中后37℃进行消化，此时胰酶的活性最强，而胚胎组织比较娇嫩，细胞容易受到损伤，因而用室温消化可以准确的控制消化的时间和程度，整个消化可以准确的控制消化的时间和程度，当细胞液里有大量细微颗粒时可及时终止消化，避免消化时间过长，消化过度。

附加成分有关猪胎儿成纤维细胞培养的另一种酶消化操作

<来自：不同方法培养猪胎儿成纤维细胞的研究>

在超净工作台上取出母猪子宫内的胎儿 ( 不要破坏羊膜) 放入含有 200IU/mL青霉素和 200μg/mL链霉素的 PBS液中, 漂洗 2～ 3 遍, 用镊子夹起胎儿, 用灭菌眼科剪剪破羊膜使胎儿流出, 放入含 100IU/mL青霉素和 100μg/mL链霉素的 PBS液中, 剪去头、 尾、 四肢并去除内脏, 剩余组织在无菌的培养皿中用眼科剪剪切成 1mm3左右的小块.

向培养皿中加入少量含 0.25%胰蛋白酶- 0.04%EDTA的消化液, 置于 4℃冰箱。冷消化 3～ 4h, 吸弃上层胰酶液, 留少量以刚刚没过组织块为宜。 然后于 39℃培养箱继续进行消

化 30～ 60min, 此时加入适量的含胎牛血清的 DMEM培养液终止消化, 并用剪口吸头反复轻轻吹打松散组织, 当其顺利通过吸管口时, 示消化合适。后加入 1mL39℃预温的 D～

MEM/F- 12 培养液 (含 20%胎牛血清, 2mmol/L 谷氨酸胺,100IU/mL青霉素和 100μg/mL 链霉素), 吹打均匀后, 用培养液调整细胞密度至 5× 105～ 1× 106个细胞 /mL。置于 39℃,饱和湿度, 5%CO2 培养箱中培养。48～ 72h 后观察, 发现贴壁后更换一半或全部培养液, 此后每两天更换一次培养液。

当原代细胞生长至 90%汇合时, 吸出培养液, 用 PBS 冲洗 1～ 2 遍, 加入适量的 0.25%胰蛋白酶消化液于 39℃消化约2～ 3min, 最好不超过 5min。在显微镜下观察, 待

大部分细胞变圆时, 立即加入适量 D-MEM/F- 12+10%胎牛血清培养液终止消化, 轻轻吸打, 制成细胞悬液, 1000rpm 离心 5min 后弃上清, 接种于其他培养瓶中继续培养。原皿中贴壁较紧的上皮细胞和未消化的成纤维细胞可继续培养。

细胞铺满瓶底后, 消化、 收集细胞, 离心(1000rpm, 7min),小心吸除上清液, 加入 4℃预冷的细胞冻存液重悬细胞, 使细胞密度达到 1～ 3× 106个细胞 /mL, 转入细胞冻存管中, 做好标记, 放入 4℃ 40min, 然后置于- 20℃ 2h, 再于- 70℃过夜,第2d 取出冻存管放入液氮罐中。

将冻存管从液氮罐中取出, 迅速放入 42℃水浴锅中融化。吸出细胞悬液, 用含10%标准胎牛血清和 100U/mL青霉素、 100μg/mL链霉素的 MEM培养液充分悬浮细胞, 接种于培养瓶内,置于 39℃、 5%CO2 培养箱中培养。

复苏后的细胞制成细胞悬液后, 记数, 取 24 孔板, 每孔接种等量的细胞悬液, 置于培养箱中培养, 一般细胞密度为1～ 5× 105个 /mL, 每天定时收集细胞, 记数, 取平均值, 绘制细胞生长曲线。

二 ， 组织块法培养的猪胎儿成纤维细胞

<来自：不同方法培养猪胎儿成纤维细胞的研究>

在超净工作台上取出母猪子宫内的胎儿 ( 不要破坏羊膜) 放入含有 200IU/mL青霉素和 200μg/mL链霉素的 PBS液中, 漂洗 2～ 3 遍, 用镊子夹起胎儿, 用灭菌眼科剪剪破羊膜使胎儿流出, 放入含 100IU/mL青霉素和 100μg/mL链霉素的 PBS液中, 剪去头、 尾、 四肢并去除内脏, 剩余组织在无菌的培养皿中用眼科剪剪切成 1mm3左右的小

块.

在剪切过程中, 向组织块加入 1～ 2滴培养液, 以保持湿润。将剪切好的组织碎块用吸管移入培养瓶中, 均匀地平铺于培养瓶底部, 组织小块间距以 0.5cm为宜, 加入微量的含 20% FCS 的 DMEM培养液, 轻轻翻转培养瓶, 另瓶底向上, 翻瓶时勿另组织小块流动, 于 39℃饱和湿度 CO2 培养箱中培养 5h 左右, 待组织块粘着牢固后, 翻转培养瓶并补加适量培养液, 使培养液慢慢浸润组织块, 继续放入培养箱中培养, 待细胞从组织块游出数量增多后, 再补加培养液, 之后隔天换液一次。

细胞传代同上。组织块法培养猪胎儿成纤维细胞, 接种后 1d 组织块就可贴壁。3d 后, 组织块周围开始有较多成纤维细胞游离出来 。5d 后, 组织块周围游离出的成纤维细胞很多, 呈梭状延伸且呈优势生长, 但组织块间仍有间隙; 游离出来的成纤维细胞开始迁移到距组织块较远的地方。随后, 组织块周围有大量的成纤维细胞包绕。 7d 后, 成纤维细胞生长旺盛, 组织块之间仍有间隙。11d 后, 细胞连生, 密度增大( 图 5) 。用该法培养原代细胞生长比较慢, 大约需要 9～ 11d 方可长满传代, 但细胞在传代后生长十分迅速, 3～ 4d 就可传一代。贴壁生长的成纤维细胞多呈梭形长条状、 不规则三角形、 漩涡状或放射状排列.

不同方法对细胞贴壁和生长增殖有明显影响, 胰蛋白酶冷热处理结合法对细胞的损伤较少, 细胞产量较高。这样即能获得的大量细胞, 并且细胞容易贴壁生长, 还有很重要的一点是操作时间的自由度较大。组织块培养法既简单易行, 又避免了高浓度消化液对组织的损伤, 此种方法培养的细胞组织块的大小和细胞游离出的数量和时间有密切关系。组织块大于 3mm3, 细胞游离出来的时间较长。组织块在 1～ 3mm3时, 在第 2d 就有细胞游离出来。 从组织块游离出来的细胞形态好, 且生长迅速。 说明组织块培养法对细胞伤害最小, 细胞的分裂能力强, 但是原代培养需要的时间长。实验室观察认为, 细胞在达到

80%～ 90%汇合时应传代, 传代后的细胞密度在 3× 104～ 5× 105个 /mL较为合适, 在此细胞浓度下, 细胞生长迅速, 细胞传代时间最好不要超过一周, 否则会引起细胞形态不正常, 继续传代会有一定困难。

影响细胞冻存的因素包括冷冻温度, 冷冻速度, 冻融速度及冷冻保护剂类型。根据经验, 细胞冻存效果的好坏与细胞在冻存液中的分散程度密切相关, 细胞分散越好冻存效果越好。分散细胞时以冻存液中看不见细胞沉淀为标准。细胞复苏时 42℃水浴比较好, 可使之迅速通过细胞最易受损伤的- 5℃。采用此实验方法, 冻存复苏细胞的成活率高于 90%,细胞复苏后具有正常的结构和形态, 并保持旺盛的生命力。