猪圆环病毒病实验室检验技术研究进展
慕泽鑫1,2,3,刘珊1,张社民3,高英杰1,刘国文1,赵建增2,仝利剑1
(1.吉林大学畜牧兽医学院,长春 130062;2.北京大北农集团动物医学研究中心,北京100080;
3.山西省芮城县家畜家禽疫病防治站,芮城 044600)
摘要:随着规模化养猪业的不断发展,猪Ⅱ型圆环病毒(PCV22)引起的疫病呈上升趋势,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。作者简要介绍了猪圆环病毒分类、分子结构特征、理化特性、生长特性等,对PCV22的ORF1、ORF2、ORF3蛋白的功能、特性及在疫苗、临床检测等方面的应用进行了阐述。主要就实验室检验技术,如免疫组织化学技术、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应、原位核酸杂交试验等研究进展进行了综述。
关键词:猪圆环病毒病;实验室检验技术
中图分类号:S858128 文献标识码:A 文章编号:167127236(2008)0620102204
断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning
multisystemicwastingsyndrome,PMWS),主要是由猪圆环病毒(porcinecircovirus,PCV)2型所引起。PMWS主要发生于5～16周龄的断奶仔猪,但常见于6～8周龄猪,哺乳猪很少发病。潜伏期为2周,猪群患病率为3%～50%,发病猪中大约有半数于2～8d内死亡,其它半数猪在衰弱状态下残存数周,几乎没有康复的猪,致死率为80%～100%。典型的临床症状包括:食欲不振、生长迟缓、被毛粗乱、皮肤苍白、常伴有黄疸;站立不稳、呼吸困难、咳嗽、水样下痢或黑便(Straw,2000)。
研究结果表明PCV22还与新生仔猪先天性震颤、怀孕母猪繁殖障碍以及猪皮炎与肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)等疾病有关。我国学者通过DNA序列分析证实,PCV22中国分离株与国外分离株同源性不是
收稿日期:2007212203
作者简介:慕泽鑫(1984-),男,新疆人,硕士生,研究方向:动
物营养代谢与中毒病。
通讯作者:张社民(1956-),高级兽医师。
基金项目:山西省科技攻关计划项目(2008031103622)。
很高,从而推测PCV22在我国已存在了较长时间,因经过多年的流行,病毒发生了变异。1 病原特征
PCV由Tischer于1974年首次在PK215细胞
中发现,是已知动物病毒中最小的一种病毒,属于圆环病毒科。该科病毒的共同特征为:无囊膜,由衣壳蛋白和基因组组成,其基因组为一个单股呈圆环状的DNA链。同属圆环病毒科的病毒包括植物病毒和动物病毒(Hattermann等,2003)。其中,动物病毒包括:鸡贫血病毒、鹦鹉喙羽病毒、金丝雀圆环病毒、鸽圆环病毒、鹅圆环病毒及人输血传播病毒(transfusiontransmittedvirus,TTV)(TTV为人的一种肝炎病毒,非A2G型,亦为一种圆环病毒,核酸序列与鸡贫血病毒有较高同源性,是迄今发现唯一的人类圆环病毒)。
猪圆环病毒(殷震等,1997)粒子直径14～25nm,为二十面体对称结构,浮密度为1.36～1.37g/ml,沉降系数为52s。衣壳蛋白为1条多肽链,其分子量为3.6×104Da,病毒基因组是1条共价结合形成闭环状的DNA单链,DNA长约1760bp左右,分子3次,每次间隔7～10d,方能杀灭新孵出的螨虫,以
存在,并作疥螨检查,确认无疫情者,方可合群。坚持
“以防为主”的方针,有计划地对饲养牛群定期驱虫;同时应加强饲养管理,保持圈舍宽敞卫生、干燥、透光和通风良好,定期对圈舍和用具清扫和消毒;经常注意畜群皮肤有无发痒、掉毛现象,发现后应及时隔离饲养和治疗。治疗期间,应注意对饲养人员、圈舍、用具同时进行消毒,以免病原散布,不断出现重复感染。
由于大部分药物对虫卵无杀灭作用,治疗时可根据虫体的生活史和使用的药物情况重复用药2～
期达到彻底治愈的目的。同时笔者通过多年的临床观察,认为虽然对此病有多种治疗方法,但是,药物肌肉注射和经口给予比药物外用的方法治疗效果好。原因是肌肉注射和经口给予药物可通过血液一次性输送到全身,对全身虫体可一次性彻底杀灭。而药物外用,则具有局限性。不能一次大面积用药,对多个病灶,虫体很容易产生耐药性,从而形成顽固性疥螨病。
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中国畜牧兽医 2008年第35卷第6期流行病防治・103・
量为0.58×106Da。PCV能够持续感染PK215细胞,在vero细胞、恒河猴肾细胞、BHK221细胞上也能生长,只是生长较慢,不会引起细胞病变CPE(cy2topathiceffect)。PCV在pH3的酸性环境及氯仿中可以存活较长时间,并可耐受70℃15min,56℃时不能将其灭活,但对苯酚、季胺类化合物、氧化剂等较敏感。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列可将PCV分为PCV21和PCV22两个血清型(Allan等,1999),目前认为PCV21对猪无致病性,为非致病性PCV;PCV22对猪有致病性,可引起PMWS。同一血清型内部各毒株核苷酸序列非常保守,同源性均在90%以上,而两种血清型毒株之间的序列相似性低于80%,二者的核酸同源性只有68%～76%。
具有致病性的PCV22全基因长1767～1768bp,有11个开放阅读框(openreadingframe,ORF),其中最主要的是ORF1和ORF2。ORF1包括945bp,编码315个氨基酸,编码与病毒复制相关的蛋白,分子量大约是35.7kD,与PCV21的ORF1编码的蛋白有相同的抗原性,是不同PCV之间产生抗原交叉反应的主要原因;ORF2包括702bp,编码234个氨基酸,编码核衣壳蛋白,分子量大约是27.8kD,作为与病毒免疫相关的主要结构蛋白,它具有较好的免疫原性,是构建重组疫苗和检测的首选基因。通过流行病学和同源性分析发现,PCV21与PCV22的ORF1较为保守,核苷酸同源性为83%,
进行确诊;同时猪群中普遍存在PCV22抗体,仅凭PCV22抗体阳性或出现疑似症状及流行病学调查,是不足以作出准确判断的。另外,PCV22虽能在一些细胞中生长但不会引起CPE,这给细胞生物学检验带来困难。因此必须选择和运用实验室方法,检测病毒抗原/抗体或核酸。实验室常用来检测PCVD的技术主要包括:免疫组织化学、血清学、分子生物学方法等。2.1 免疫组织化学方法(IHC) IHC是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下,借助于酶或荧光细胞化学的手段,检测病原物质在组织细胞分布的一项技术。其准确性高,除了常规检验外,还常作为金标准用于评价其他检测技术性能。
Staebles等(2005)利用单克隆抗体的IHC方法,针对PCV22ORF2遗传密码的衣壳抗体,检测28个农场39头猪的组织标本中是否存在抗体;由于病毒承载量与临床症状的严重程度呈正相关,因此也可通过IHC方法结合病理组织学,对感染猪的淋巴组织和肝脏进行检测,测定感染PCV22的承载量(Krakowka等,2005);还有专家用IHC从流产胎儿和死产仔猪的巨噬细胞中检测出PCV22的抗原(Kim等,2004)。将组织病料接种PK215细胞玻片培养,丙酮固定,用兔抗PCV高免血清与细胞培养物中的PCV反应,建立间接免疫荧光试验(IIF),可对PCV进行检测和定型,其特点是快速、特异、敏感,常用于PCV感染的血清学普查。Zhou等(2005)用IIF
氨基酸同源性为86%;而二者的ORF2差异较大,核苷酸同源性为67%,氨基酸同源性为65%(Stein2feldt等,2001)。因此,根据ORF2蛋白的抗原性不同可以把二者区别开,在检测中做到对PCV进行正确分型。除了上述病毒复制相关的ORF1和衣壳蛋白ORF2之外,近几年又出现了关于PCV22的新蛋白ORF3的报道,目前ORF3在PCVD病理学及疾病防控中的意义是一个研究热点。ORF3包括315bp,编码105个氨基酸,分子量大约是11.6kD,它在病毒的复制过程中存在。已通过BLAB/c小鼠模型试验证明,它虽然不是病毒在培养细胞中进行复制所必需的,但是存在一定的诱导细胞凋亡的功能,与病毒致病性相关(Liu等,2006)。由于PCV21和PCV22的ORF3同源性仅为62%左右,有学者推测这可能为两者是否具有致病性的关键之一。而其他蛋白的功能还有待进一步的研究。2 实验室检验技术
由于猪圆环病毒病易与一些病毒性或细菌性疾病混合或继发感染,在临床上仅根据临床症状难以
对浙江省46个猪场的2062份血清进行检测,结果46个猪场均有PCV感染,血清阳性率为58.34%。
但借助于酶的IHC操作比较繁琐,且须在试验过程中除去内源过氧化物酶对反应的干扰,因此检测时间往往较长。借助于荧光手段的IHC,在样品涂片观察过程中,由于游离荧光染料能和组织成分结合,以及生物组织的自发荧光,使试验容易产生假阳性而影响观察;当观察时间过长时,可能因荧光淬灭使其灵敏度下降;再者容易因观察人员的主观臆断而产生误差。2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA是一种灵敏、快速,适合于大规模检测的诊断方法。Nawagitgul等(2002)分别以细胞培养的PCV22病毒粒子和重组ORF2蛋白,作为抗原包被ELISA板,建立2种间接ELISA(indirectELISA)检测PCV特异性抗体,发现二者的敏感性、特异性和准确性相似。Walker等(2000)用PCV22单克隆抗体建立的竞争ELISA(competitiveELISA)对来自英
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・104・流行病防治中国畜牧兽医 2008年第35卷第6期
国、加拿大和法国的484份感染PCV22的猪血清,
其敏感性和特异性分别为99.58%和97.14%,其准确性已达到IIF的水平。2.3 聚合酶链式反应(PCR) 基于GenBank中发表的PCV序列,设计特异性引物进行PCR反应,可直接检测组织病料及细胞培养物中的病毒核酸。这是一种敏感、特异、快速、准确的方法,目前已成为PCV病毒学诊断、分子生物学试验中最常用的技术。根据不同需要,已有多种PCR技术用于PCV检测检验。2.3.1 多重PCR(multiplexPCR) Larochelle等(2000)首先建立此方法成功的检测出PCV,并可对PCV22定型;国内学者设计合成2对PCV型特异
时检测上述3种病毒的核酸。
2.3.6 实时定量PCR(real2timequantitative,PCR) 可用于PRRSVcDNA和PCV22DNA的定量检测(Chung等,2005)。应用该方法对自然感染猪和攻毒猪在肺、脾、扁桃体及淋巴结中PRRSV和PCV22的分布进行测定和定量研究。结果表明,PRRSV和PCV22病毒载量分别为5.73～8.38和5.65～6.91拷贝数/mg。已建立的定量PCR方法可
能是将来疫苗研制和发病机理研究的有用工具。2.3.7 限制片段长度多态性PCR(RFLP2PCR) 根据GenBank中PCV的基因序列,国内有人设计并合成了1条引物,建立RFLP2PCR方法,对PK215细胞及疑似PMWS、PDNS的病料进行了PCV
性引物,分别扩增PCV21、PCV22的938bp特异性
片段和PCV22特异性的490bp片段。在对该多重PCR的反应条件进行优化之后,建立了猪圆环病毒检测和血清型的鉴定(王新等,2006)。结果证明应用RFLP2PCR快速检测PCV是可行的,为PCV的检测、分型以及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。2.4 原位核酸分子杂交技术(ISH) Sirinarumitr等(2001)用地高辛标记的RNA探针(针对PRRSV)和荧光标记的RNA探针(针对PCV)同时做ISH,建立了双杂交方法同时检测猪PRRSV和PCV22。该方法不仅可同时检测2种病毒的感染,
多重PCR诊断方法,既可对PCV进行定性检测,又可对PCV21和PCV22进行分型。2.3.2 竞争性PCR(competitivePCR) 该方法是检测血清中的PCV核酸(Liu等,2000),选取PCV21和PCV22的ORF2中变异性高的区段设计2对
特异性引物,并引入一个外源片段的重组质粒,以此作为竞争性模板,用上述两对引物扩增出的PCV21或PCV22片段能够与野毒株的扩增片段相区别。当倍比稀释已知浓度的质粒DNA和待测DNA共同PCR产物的电泳条带亮度相同时,便可推算出待测DNA的浓度。
2.3.3 套式PCR(nested2PCR) 也称巢式PCR。Junghyun等(2001)通过设计两套引物,一套引物扩增PCV21349bp片段中的317bp,另一套引物扩增PCV22481bp片段中的225bp片段,从福尔马林固
而且可确定这2种病毒是否共同感染同一细胞。Kim等(2001)针对PCV21(ORF1)的349bp特异DNA和PCV22(ORF2)的481bp特异DNA,进行
地高辛标记,也可用于ISH,从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中检测病毒的DNA。ISH和IHC相比,二者均可被用来作为PCV22诊断的工具,但ISH比IHC更灵敏。ISH是结合病理学技术和免
疫学技术而进行的,其检测灵敏度较高,而且能够精确定位,样品可长时间保存,但是其操作复杂且需要专业人员,因此它的应用受到了极大的限制。3 展望
定、石蜡包埋的组织中检测PCV22,并将该方法与传
统的PCR方法和原位杂交法进行比较。巢式PCR也可对PCV21和PCV22进行检测并定型,并且敏感性与普通PCR相比提高了1.6倍,同时第2次扩增又可以鉴定第1次扩增的特异性,大大提高了检测的准确性。2.3.4 半套式PCR(semi2nestedPCR) Celera等(2002)通过设计的3个寡核苷酸引物进行半套式PCR来检测PCV22的DNA,结果表明该方法能特异性地扩增PCV22的DNA,并且表明该方法能有效区别PCV21和PCV22。2.3.5 多重套式PCR(multiplexnestedPCR) 可同时检测PCV21、PCV22及猪细小病毒(Kim等,2003),并同原位杂交法进行了比较。结果发现2种方法的检出率均为100%,因而证实了该法可以同
尽管世界许多实验室对PCV22所导致的各种疾病,及PMWS的人工复制等方面进行了大量的研究,使我们获得了大量的相关知识,但我们对其分子生物学特性、病毒对动物免疫系统的影响、致病机理、有效预防并控制该病毒引发的各种疾病,以及一些潜在的问题等方面缺乏全面而系统的了解。研究发现,在奶牛、小鼠和人的体内存在PCV21抗体,首次提出了PCV潜在的人畜共患性(Tischer等,1995)。后来又对奶牛和人的血清进行检测后,没有发现PCV22抗体的存在(Allan等,2000)。因此,有必要继续对PCV在公共卫生方面的意义进行更详细、更深入的研究。
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ZHAOJian2zeng2,TONGLi2jian1
(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun130062,China;
2.AnimalMedicineResearchCenter,DabeinongGroup,Beijing100080,China;
3.ShanxiProvinceBingchengDomesticAnimal&DomesticBridDiseasePrevention&CureStation,Bingcheng044600,China)Abstract:Porcinecircovirus(PCV)infectionisanimportantinfectiousdiseaseinpigsinrecentyears,whichseriouslyhin2dersthedevelopmentofpigindustry.Thepresentreviewintroducedclinicalsymptoms,pathologicalchanges,sortsofvirus,molecularconstitutioncharacter,physicsandchemistrycharacterandsoon,therein,alsoexpounditsfunction,characteristicofORF1,ORF2,ORF3proteinandaspectofapplicationinvaccine,clinicaldetection.Then,mostlyaccordingtolaboratoryde2tectionmethodstoPCVinexistence,including:thediagnostictechnologyofPCV,forexample,immunohistochemicalassay,indirectimmunofluorescentassay,enzymelinkedimmunosorbentassay,polymerasechainreactionandinsituhybridizationweresummarized.
Keywords:porcinecircovirus;laboratorydetectionmethods
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