地衣芽孢杆菌在营养肉汤中生长条件优化

作者：丁康宁，张梦洁，张艾珈，张旭 来源：《畜牧兽医科学》 2019年第18期

丁康宁，张梦洁，张艾珈，张旭

（金陵科技学院，南京 210038）

摘要：地衣芽孢杆菌有调节动物肠道内微生态平衡、增强机体的抵抗力、保护动物健康等重要的作用。试验研究了NaCl质量分数、pH值和温度对营养肉汤培养基中地衣芽孢杆菌生长状态的影响。结果表明：地衣芽孢杆菌在营养肉汤中的最佳生长条件为，NaCl质量分数范围为1%，pH值为8.0，最适生长温度为37 ℃。

关键词：地衣芽孢杆菌；营养肉汤；生长条件

中图分类号：TQ464

文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.006

0 引言

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种常见的革兰氏阳性菌。该菌能产生多种生物活性物质，包括多糖、蛋白质、非肽类物质等，它们能促进饲料中营养素降解，提高饲料利用率[1]。此外地衣芽孢杆菌还能产生多种活性酶，这些酶可以促使细胞营养物质的释放，消除饲料中的抗营养物质[2]。在不良环境中，地衣芽孢杆菌可以形成芽孢，经受颗粒饲料加工和储存中一系列恶劣环境。因此，地衣芽孢杆菌被我国农业部 2003 年 318 号公告《饲料添加剂品种目录》批准使用为饲料级菌株[3]。

试验研究了地衣芽孢杆菌在营养肉汤培养基中不同温度、不同NaCl质量分数以及不同pH值条件下的生长特性，探索地衣芽孢杆菌的最优生长条件，可以为更好的筛选地衣芽孢杆菌益生菌，研发益生菌制剂提供依据。

1 材料

1.1 试剂

营养肉汤培养基、营养琼脂培养基为杭州百思生物科技有限公司产品。蛋白胨、牛肉浸膏、NaCl、HCl、NaOH、琼脂等为国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 试验菌株

地衣芽孢杆菌菌种为本实验室保存，分离于60日龄樱桃谷鸭的小肠。

2 方法

2.1 制备种子液

从保存菌种的斜面培养基上挑取菌落，接种于营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h。挑取扁平、边缘整齐、表面光滑、粘稠，呈乳白色的菌落，接种于营养肉汤培养基中，37 ℃培养24 h。取该培养物，用无菌的生理盐水将其稀释至102～103 cfu/mL，即为种子液。

2.2 平板菌落计数

在无菌操作下，将地衣芽孢杆菌待测样品10倍梯度稀释，吸取0.2 mL不同稀释梯度的培养液均匀涂布在营养琼脂培养基上，每个梯度做 2 个平行，然后放置于培养箱中倒置培养。48 h后记录每个平板中菌落数量，并且计算出菌落总数。

2.3 温度对地衣芽孢杆菌生长的影响

取7支相同规格试管，每支试管加入9.8 mL营养肉汤培养基，121 ℃灭菌15 min。待冷却后每支试管接种0.2 mL种子液，分别置于10、15、20、25、30、37、45 ℃摇床中，180 r/min振荡培养12 h。每支试管各取 1 mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。

2.4 NaCl质量分数对地衣芽孢杆菌生长的影响

配制NaCl质量分数分别为0.5%、1%、3%、5%、7%、9%、12%的营养肉汤培养基。取7支相同规格试管，每个质量分数的营养肉汤培养基分别取9.8 mL装于试管，121 ℃灭菌1 5min。待冷却后每支试管接种0.2 mL种子液，置于37 ℃摇床中，180 r/min振荡培养24 h。每支试管各取 1 mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。

2.5 pH值对地衣芽孢杆菌生长的影响

配制营养肉汤培养基，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH将pH值分别调整为2、4、5、7、8、9、11。取7支相同规格试管，每个pH值营养肉汤培养基分别取9.8 mL装于试管，121 ℃灭菌15 min。待冷却后每支试管接种0.2 mL种子液，置于37 ℃摇床中，180 r/min振荡培养24 h。每支试管各取 1 mL培养液，梯度稀释后进行平板菌落计数。

3 结果与分析

3.1 温度对地衣芽孢杆菌生长的影响

从10～37 ℃，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现不断上升的趋势，而当37～45℃时，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势，见图1。其中在10～25 ℃范围内生长较为缓慢，在25～30 ℃范围中生长良好，最优生长温度为30～37 ℃；而当温度到达45 ℃左右，地衣芽孢杆菌的生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌的最适生长温度为37 ℃，见表1。

3.2 NaCl质量分数对地衣芽孢杆菌生长的影响

地衣芽孢杆菌的生长状态随着NaCl质量分数的增高而呈现逐渐下降的趋势，见图2。NaCl质量分数在0.5%～3%间生长较为良好，在3%～7%，地衣芽孢杆菌的生长一般，在7%～12%生长状态不良。由此可知，地衣芽孢杆菌最适NaCl质量分数为1%，见表2。

3.3 pH值对地衣芽孢杆菌生长的影响

在pH值2.0～8.0范围内，地衣芽孢杆菌的生长随着pH值的增大而呈现逐渐上升的趋势；而在pH值为8.0～11.0范围内，其生长状态开始下降。其中在pH值为2.0～3.0，地衣芽孢杆菌基本不生长，pH值为4.0～5.0时生长逐渐开始增快，pH值在5.0～9.0范围内生长状态较好，pH为8.0时达到最大值。pH值大于9.0以后生长受到抑制，至pH值11.0时几乎停止生长。由此可知，地衣芽孢杆菌最适生长pH值为8.0。见图3、表3。

4 讨论

随着人们生活水平的提高和对健康的重视，益生菌作为绿色饲料添加剂越来越受到人们的青睐，益生菌的开发和应用必将对我国养殖业的发展起到积极作用[4]。地衣芽孢杆菌是一种安全、有效、抗逆性强、营养要求低的一种益生菌。试验讨论了营养肉汤培养基中不同的温度、NaCl质量分数、不同pH值条件对地衣芽孢杆菌生长状况的影响，便于我们对益生菌制剂的研发。

5 结论

随着温度的上升，地衣芽孢杆菌的生长状态不断上升，超过37 ℃后，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。而当温度到达45 ℃左右，生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌对温度的耐受性较高。随着NaCl质量分数增加，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。NaCl质量分数在0～3%范围内生长最好，超过10%后，生长状态几乎停止。由此可知，地衣芽孢杆菌对NaCl的耐受性较高。随着pH值的上升，地衣芽孢杆菌的生长状态不断上升。pH值超过8.0后，地衣芽孢杆菌的生长状态呈现下降趋势。最适pH值的范围为5.0～9.0，而当pH值大于11，生长状态几乎停止。地衣芽孢杆菌对酸碱的耐受性较高。由此可见，地衣芽孢杆菌对培养基要求不高，易于培养，这与刘岩[5]等的研究结果一致。

参考文献

[1] 杨阳，张付云，苍桂璐，等．地衣芽胞杆菌生物活性物质应用研究进展[J]．生物技术进展，2013，3 （1）： 22-26．

[2] 曹煜成，李卓佳，冯娟，等．地衣芽孢杆菌胞外产物消化活性的研究[J]．热带海洋学报，2005 （6）：6-12．

[3] 中华人民共和国农业部公告[J]．湖南饲料，2006（5）：5-6．

[4] 廖智慧，陈志军，赵晓静，等． 复合益生菌制剂应用现状及发展趋势[J]． 畜牧兽医科学（电子版），2019（2）：26-27．

[5] 刘岩，仪淑敏，励建荣，等．地衣芽孢杆菌在营养肉汤中生长模型的建立[J]．食品与生物技术学报，2014，33（10）：1 025-1 030．