溶藻细菌L7溶藻活性代谢产物的分离鉴定_张涵之

溶藻细菌L7溶藻活性代谢产物的分离鉴定

张涵之,潘伟斌*,马 超 (华南理工大学环境科学与工程学院,广东 广州 510006)

摘要：在对溶藻细菌L7所分泌的溶藻活性物质进行分离和纯化后,通过质谱法、紫外光谱扫描法、红外光谱扫描法以及特征显色法对该活性物质进行了初步鉴定.结果表明,质谱分析出第12#组分中的5种物质分子量分别为243.7,364.0,508.1,602.1,678.7.紫外光谱扫描分析出溶藻细菌L7溶藻活性代谢产物可能含有2个共轭的不饱和键.红外光谱扫描和薄层层析特征显色结果显示,其可能含有芳香醛类、氨基酸类、醇类或糖类物质,但一定不含有酚类物质. 关键词：溶藻细菌；溶藻活性物质；分离；鉴定

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2010)S0-0019-05

Isolation and identification of the extracellular algae-lysing components from algae-lysing bacterial strain L7. ZHANG Han-zhi, PAN Wei-bin*, MA Chao (College of Environmental Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China). China Environmental Science, 2010,30(Suppl.)：19~23

Abstract：Following the isolation and purification of active compounds secreted by algicidal bacteria L7, the analytical methods of L7, LC-MS, UV, IR and TLC were applied to identify the active compounds .The LC-MS showed that the 12# component contains five compounds, whose molecular weights are 243.7, 364.0, 508.1, 602.1, 678.7, respectively. The results of UV indicated that the structure of algicidal compounds might contain two conjugated and unsaturated bonds. The results of IR and TLC indicated that the active compounds might contain aromatic aldehyde, amino acid, alcohol or the saccharide, but not phenol.

Key words：algicidal bacteria；extracellular algae-lysing constituents；isolation；identification

近30年来,有害藻类大量繁殖所引发的水华现象日渐增多,溶藻细菌作为一种生物控制手段,显示出了极大的潜力[1].本课题组从广州城区某富营养化池塘中分离、筛选并鉴定出一株溶藻细菌(蜡状芽孢杆菌)L7[2].该细菌通过分泌胞外溶

-藻物质的方式进行间接溶藻[23].在前期工作

-中[35],对胞外溶藻物质的特性进行了初步研究,并了解到该物质具有极性大、分子量小的特点.为了能够最终研制出高效的杀藻剂,本研究通过质谱、紫外光谱、红外光谱和特征显色等方法对该细菌胞外溶藻物质进行了考察.

1.2 无菌滤液的制备

分别用5mL无菌水从每支保存有溶藻细菌的斜面培养基上洗脱菌苔,菌悬液按1:50的比例接种于液体淀粉培养基中.将接种后的液体培养基装入已灭菌的具塞锥形瓶中,置于恒温摇床中.以 30℃恒温、120r/min转速振荡培养4d后,以4000r/min离心20min, 收集上清液.上清液经0.22µm微孔滤膜抽滤2次,以平板法检验无菌后,制成溶藻细菌无菌滤液(以下简称无菌滤液).

1.3 活性代谢产物粗提取物的制备

取1L无菌滤液,75℃旋转蒸发浓缩至100mL.

1 材料与方法

用2倍浓缩液体积的四氯化碳萃取浓缩液,共萃

1.1 供试藻种 取2次,每次静置24h.合并水相,用冷冻干燥机干

本试验用于溶藻活性检测的藻为水华鱼腥燥,获得10.3g固体物质.取2.8666g冷冻干燥物,藻(Anabaena flos-aquae FACHB-245),来自中国溶于甲醇中, 4000r/min离心10min,取上清液,定 科学院水生生物研究所藻种保藏中心.该藻利用收稿日期：2009-10-30

* 责任作者, 高级工程师, ppwbpan@scut.edu.cn BG11培养液[6]进行培养.

20 中 国 环 境 科 学 30卷

容至25mL,得到“甲醇溶解相”,即为活性物质粗提取物.

1.4 仪器与试剂

旋转蒸发仪(RE-2000型);冷冻干燥机(Virtis 4K型);聚偏氟乙烯微孔滤膜(金晶牌 Φ50mm,0.22µm F型);薄层层析硅胶板(海洋牌25mm×75mm GF254);紫外-可见分光光度计(UV-2800AH型);高效液相色谱(U3000型戴安公司);液相色谱—质谱联用仪(Esquire HCT PLUS 大容量离子阱LC/MSn);Vector 33型傅立叶变换红外光谱仪.

实验所用药品有四氯化碳(分析纯);甲醇(分析纯、色谱纯);蒸馏水;乙酸乙酯(分析纯);冰乙酸(分析纯);葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20);超纯水.

1.5 物质活性检测方法

在液体BG11培养基中加入1.5%的琼脂,高温灭菌制备无菌BG11固体培养基.取10mL藻液,在4000r/min下离心5min,弃去上清液,在培养基为液体状态时,倒入离心管,使藻液再悬浮,然后倒平板,静置待其冷却凝固,获得水华鱼腥藻固体平板.随后,置于人工气候箱中在23±0.5℃、光照强度3000lx、光暗周期比12h:12h条件下,倒置培养.待藻均匀生长于平板上后,取直径为7mm的中速滤纸,沾取浓缩无菌滤液后贴于平板上,将平板倒置于光照培养箱中培养,观察其溶藻斑大小. 1.6 活性物质的纯化

葡聚糖凝胶在4℃条件下保存,甲醇浸泡.直接倒取200mL凝胶,依次用蒸馏水、NaOH-NaCl (8,30g/L)溶液、蒸馏水和甲醇溶液冲洗凝胶,各溶液的用量均为 1L.在装填凝胶柱之前,用真空泵对洗净凝胶进行抽气泡处理,随后,将凝胶装入玻璃层析柱中.待装柱完成后,用一滤纸片轻轻盖在凝胶床表面,以保持凝胶表面的平整.装填好的柱子待凝胶完全沉降后,开始平衡处理.由于所装柱床体积为 200mL,因此用 600mL (3倍柱床体积)甲醇以 2mL/min 的流速对装好的层析柱进行平衡.

从甲醇溶解相中吸取10mL溶液作为进样样品,用恒流泵以2mL/min的流速从柱顶端加入

甲醇洗脱剂.本研究中,凝胶柱的保留体积约为95mL.为使样品可以得到较好的分离,用500mL (大于 5 倍保留体积)的甲醇对样品进行洗脱,用10mL 的容量瓶对洗脱组分进行收集,甲醇溶解液样品获得50个洗脱组分,将其置于4℃的环境中保存,待用.在得到溶藻活性物质甲醇溶解相的凝胶柱层析分离组分后,对所获得的50个组分进行紫外光谱扫描,从中选取具有代表性的部分组分进行溶藻活性检测,并利用高效液相色谱检测活性组分,从中选取具有溶藻活性的组分,对其中所含的活性物质进行鉴定. 1.7 活性物质的鉴定

1.7.1 质谱法 利用液相色谱—质谱联用仪,对活性组分中所含物质的分子量进行定性分析. 1.7.2 紫外吸收光谱法 采用紫外-可见分光光度计,对活性组分中的各组成物质进行波长190~400nm的紫外光谱扫描及定性分析.

1.7.3 红外吸收光谱法 采用液膜法,对活性组分进行傅立叶变换红外光谱仪扫描,对其物质性质等信息进行定性分析.

1.7.4 特征显色法 活性组分经薄层层析展开后(展开剂体积比为甲醇:乙酸乙酯:乙酸=2:6:8),用联苯胺/三氯乙酸糖类特征显色剂显色. 2 结果与讨论

2.1 活性物质的纯化

对凝胶柱层析洗脱组分进行紫外光谱扫描以及利用高效液相色谱检测其组成.洗脱组分紫外光谱扫描图谱见图1.

由图1(a)可以看出,1#~10#洗脱组分中所含物质是相似的.图1(b)显示11#~20#洗脱组分中所含物质与前10个洗脱组分中所含物质有较大的区别.21#~50#洗脱组分中所含物质也基本相似(图略).因此本研究选取了1#,9#,11#,12#和31#洗脱组分作为全部洗脱组分的代表,进行物质的溶藻活性检测.检测结果如图2所示.

由图2可以看出,所检测的5个洗脱组分中,仅有12#洗脱组分对藻的生长起到了抑制的作用.随后使用高效液相色谱对12#活性组分进行测定,获取组分中物质的相对含量及所含种类的定性

增刊 张涵之等：溶藻细菌L7溶藻活性代谢产物的分离鉴定 21

分析.高效液相色谱的工作条件为:柱温35℃,流描时间18min.由表1可以看出,该活性组分中含速1.0mL/min,流动相体积比为甲醇:水=70:30,扫有多种物质.

3.0 1.0 0.8 ABS 0.6 0.4 0.2 0

210 220 230 240250波长(nm)

260270280 390400 (a) 1#~10#洗脱组分1# 2# 3# 4# 5# 6# 7# 8# 9# 10#

11#12#13#14#15#16#17#18#19#20#3.0 1.5 1.2 0.9 ABS 0.6 0.3 0.0 -0.3 -0.6 210 220 230 240 (b) 11~20洗脱组分##250波长(nm)

260270 390400

图1 1#~20#洗脱组分紫外光谱图

Fig.1 Ultraviolet chromatograms of 1~20# components eluted from Sephadex LH-20

(a) 1洗脱组分 (b) 9洗脱组分 (c) 11洗脱组分 (d) 12洗脱组分 (e) 31洗脱组分

#

#

#

#

#

图2 各洗脱组分的溶藻效果比较

Fig.2 Algae-lying effects of 1#, 9#, 11#, 12# and 31# components eluted from Sephadex LH-20

22 中 国 环 境 科 学 30卷

表1 12#活性组分的高效液相色谱数据

2.2 质谱鉴定

high performance liquid chromatogram Table 1 Datas of

根据质谱结果,在第12#组分中共分析出5种of 12# active component

物质,它们的分子量分别为243.7,364.0,508.1,

出峰时间 峰高 峰面积 峰面积

602.1,678.7.5种物质的质谱数据如表2所示. 序号

(min) (mAU) (mAU×min) (%)

Lee等[7]发现1株假交替芽孢杆菌,其产生的1 2.66 37.682 8.934 31.30

2 3.01 0.602 0.031 0.11 对硅藻有溶藻效果的丝氨酸蛋白酶,分子量为3 3.13 0.721 0.044 0.15

50KDa.Nakamura等[8]发现1株蜡状芽孢杆菌,其

4 3.38 29.784 9.346 32.74

产生对铜绿微囊藻具有溶藻效果的物质分子量5 3.82 2.360 0.240 0.84

[9]

6 5.34 5.917 6.321 22.15 在 2KDa 以下.Kim 等分离出1株溶藻细菌7 6.92 0.111 0.026 0.09 (AFK-13),其无菌滤液中分子量为50~100KDa8 7.31 0.017 0.002 0.01

的蛋白质类物质,对水华鱼腥藻具有显著溶藻效

9 7.49 0.009 0.000 0.00

10 12.43 14.841 3.598 12.61 果.而溶藻菌 L7 的活性物质分子量在 0.2~ 合计 92.045 28.534 100.00 0.7KDa之间,可能为一种新的溶藻活性物质.

表2 5种物质质谱数据

Table 2 The mass spectrum data of the five compounds

物质分子量 质谱峰号 质荷比 丰度 相对丰度(%)物质分子量 质谱峰号质荷比 丰度 相对丰度(%)

243.7 1 244.7 13576 100.0 602.1 2 601.1 32412 100.0 364.0 364.0 508.1 508.1 508.1 508.1 508.1 508.1 508.1 602.1

1 3 1 2 3 5 6 7 8 1

305.0 348.1 347.0 365.1 467.2 527.1 689.3 777.2 1015.0 439.1

26101 23455 27224 12189 14641 1583692 20995 9551 17694 763

0.5 0.4 1.7 0.8 0.9 100.0 1.3 0.6 1.1 2.4

602.1 602.1 602.1 602.1 602.1 678.7 678.7 678.7 678.7 678.7

3 5 7 8 9 2 3 4 5 6

602.9 933.5 1004.0 1054.1 1085.2 680.4 713.5 723.5 724.4 726.3

532 394 861 441 963 4096 6141 20371 8483 2393

1.6 1.2 2.7 1.4 3.0 1.7 2.5 8.4 3.5 1.0

364.0 2 347.1 109137 2.0 602.1 4 763.2 886 2.7 364.0 4 365.0 5327891 100.0 602.1 6 1003.1 1730 5.3

508.1 4 509.1 11439 0.7 678.7 1 677.7 243891 100.0

2.3 紫外光谱鉴定

对12#活性组分的紫外光谱扫描,结果如图3所示.该组分在220nm处有一个明显的吸收峰.说明在该组分中,溶藻活性物质中可能含有共轭的2个不饱和键结构. 2.4 红外光谱鉴定

对12#活性组分进行红外光谱分析,结果见

---图4.由图4可见,1660cm1、2830cm1、1450cm1处出现的特征吸收峰表明,该组分中的溶藻活性

--物质可能含有芳香醛类;1420cm1、1660cm1、

--2600cm1、2940cm1处出现的特征吸收峰表明,

该组分中的溶藻活性物质可能含有氨基酸类. Yoshikawa 等[10]从海水中分离、筛选出1株具有抗蓝藻活性的细菌,其产生的具有杀藻作用的生物活性物质为强亲水性化合物β-氰基-L-丙氨

--3300cm1处出现的特征性吸收峰表酸.1120cm1、

明,该组分中的溶藻活性物质可能含有醇类.同时,

--因为在1410~1310cm1、1260~1170cm1处没有特征吸收峰,推断该物质不含有酚类. 2.5 特征显色鉴定

12#活性组分展开的薄层板喷洒联苯胺/三氯乙酸糖类特征显色剂,于105℃下加热15min

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后,板上出现了棕黄色的点,这些点的出现表明该活性组分中溶藻活性物质可能含有糖类物质.Wang等[11]从铜绿假单胞菌的胞外物质中分离出1种对赤潮异湾藻有很强抑制作用的物质.经鉴定,该物质是由Rha-Rha-C10-C10和Rha- C10-C10组成的鼠李糖脂.

1.0 0.8 0.6 ABS 0.4 0.2 0.0 -0.2 220 240 260 280 300 320 340 360380400

波长(nm)

含有2个共轭的不饱和键.

3.3 红外光谱扫描的结果表明,活性物质可能含有芳香醛类、氨基酸类、醇类,但一定不含有酚类物质.

3.4 根据薄层层析特征显色得到的结果,推断活性物质还有可能含有糖类物质.

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图3 12#活性组分的紫外光谱图

Fig.3 Ultraviolet chromatogram of 12# active component

eluted from Sephadex LH-20

100 80 1670 透过率(%) 60 40 20 1420 33002830 29401450 0 600 900 1200 1500 18002100 2400 2700 30003300-波数(cm1)

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图4 12活性组分的红外光谱图

Fig.4 Infrared spectrogram of 12 active component

eluted from Sephadex LH-20

#

#

3 结论

3.1 质谱法检测出活性组分中的5种物质,它们的分子量分别为243.7,364.0,508.1,602.1,678.7. 3.2 通过紫外光谱扫描法,得知活性物质可能

作者简介：张涵之(1987-),女,陕西汉中人,华南理工大学环境科学

与工程学院硕士研究生,研究方向为生态工程与环境修复.