文献

对于camalexin生物合成所需的拟南芥PAD3基因，编码一个假定的

细胞色素P450单加氧酶

周楠，a,b、媂娜L.图特和简·格雷兹布鲁克

a、 美国马里兰大学帕克分校生物技术学院的农业生物技术中心，马里兰州20742

b、 美国马里兰大学帕克分校细胞生物学和分子遗传学系，马里兰州20742

介绍

植物抗毒素是低分子量的抗菌化合物，在响应于病原体的攻击的合成。植物抗毒素camalexin，吲哚衍生物，是通过对感染的反应与拟南芥产生细菌性病原体丁香假单胞菌。植物抗毒素的不足3（PAD3）突变，从而导致camalexin生产缺陷，对电阻有无影响，但妥协的丁香假单胞菌的抗真菌病原体链格孢胸罩sicicola。我们已经通过以地图为基础的克隆把PAD3分离出来。以预测的PAD3蛋白似乎是一种细胞色素P450单加氧酶，类似于玉米催化衍生的二次metabolite2,4-dihydroxy-1,4-benzoxazin-3-one吲哚合成。PAD3的表达与camalexin合成紧密相关，通过 PAD4和PAD1大量注册。基于这些结果，我们得出这样的结论：PAD3几乎肯定将camalexin生物合成编制成了所需的酶。此外，这些结果也有力地表明：虽然camalexin是参与抗真菌病.但是它不在植物对丁香假单胞菌感染抗病性方面发挥了重要作用。

植物进化出一连串的生化和分子的武器抵御入侵微生物病原体。病原体入侵触发防卫反应的激活，包括活性氧和等信号分子如水杨酸（SA）的合成，抗菌代谢产物的积累，和一些防御相关基因的表达：编码发病机制相关（PR）蛋白。在某些情况下，一个电位病原可能触发一种形式的抗性基因的抗性强，这是由病原菌无毒基因产品的相应的植物抗病基因介导的。在这种情况下，植物抵御反应迅速激活，疾病不发生，病原体是无毒的。抗性基因不是致命的病原体引发的，然而，其结果是防御反应对这些病原体的启动比较慢；因此，疾病的发生紧跟着这些不太有效的反应。在过去的几年里，阐明机制的防御反应的活性和抑制病原体的生长已经得到广泛关注。（哈蒙德Kosack和jones1996Glazebrook等人，1997年）。拟南芥是一个理想的模型系统研究，并对各种各样的特定的防御反应的许多突变已经确定这个物种（Glazebrook等人。，1997年）。

植物抗毒素是低分子量的抗菌me—tabolites响应于病原体的攻击的植物产生的（帕克斯顿，1981）。varyamong植保素的化学结构和不同的植物科包括黄酮类化合物，terpe线圈，和吲哚（1984 Darvill和阿伯斯海姆，）。抗微生物性能的植保素建议他们在机械位势函数方面提高宿主防御能力。尽管这植物抗毒素已是多年的广泛研究，很少有直接的证据表明他们是否对植物防御特定病理一族有重要贡献。已在Arabi—dopsis中检测到的唯一的植物抗毒素是一种吲哚衍生物，被称为camalexin（3-thiazol-2-基吲哚）（Tsuji等人。，1992）。然而在组织camalexin与真菌玉米碳接种后（glazebrooket Al。1997b），发现camalexin是由无毒的细菌或病毒的丁香假单胞菌菌株感染的ulent积累的（tsujiet等人。，1992；Glazebrook和奥苏贝尔，1994）。体外研究表明了camalexin抑制细菌和真菌的生长（jejelowo等人。，1991；Tsuji等人。，1992；Rogers等人。，1996）。

几乎没有人知道关于camalexin生物合成。因此在分析色氨酸缺乏的阿拉比dopsis突变体camalexin积累和放射性标记化合物为camalexin时他们建议camalexin生物合成途径的起源具有色氨酸的途径，它在邻氨基苯甲酸和吲哚之间的一个中间的掺入（Tsuji等人。，1993）。最近的研究表明，吲哚为前驱体，camalexin和噻唑环的Camalexin来自半胱氨酸（祖克和哈默施密特，1997；祖克，1998）

在生产和显示对许多病原体特定的更改的方面，拟南芥植物是抗毒素缺失突变体（PAD）的植物抗毒素（Glazebrook和奥苏贝尔，1994；Glazebrook等人。，19961997b；周等人。，1998）。在PAD1 PAD2和PAD4而不是PAD3或PAD 5的突变中，显示致命的丁香假单胞菌菌株有着强大的敏感性（Glazebrook andausubel，1994；Glazebrook等人。，1997b）。PAD4变异导致植物变得比野生型植株更容易与通常不相容的OO霉菌寄生霜霉分离株（Glazebrook等人。，1997b）真菌也是如此（他等人。，1998）。另外，PAD3植物被认为比野生型植物更容易受影响（thomma等人。，1998）。

我们提出了一个模型来解释垫突变体的表型（Glazebrook和奥苏贝尔，1994；Glazebrook等。，1997b；周等人。，

1998）。PAD3或PAD 5只引起camalexin合成缺陷的突变，在抗丁香假单胞菌方面camalexin确实不起主要作用。另一台控制malexin基因编码的钙的合成以及其他的防御反应的调控因素。正是这些其他的防御反应，有助于植物对对丁香假单胞菌的电阻。在这个模型的支持下，我们发现了PAD4影响camalexin合成相关基因PR-1发病机制调节（Zhou等人。，1998）。活化 camalexin合成和PR-1的表达需要信号分子SA。SA对 PR-1的表达是足够的而且是必要的，但对于camalexin的合成是不充分的（赖尔斯等人，1996；赵。最后，1996；周等人。，1998）。PAD4似乎在对丁香假单胞菌菌的株防卫反应的激活毒力下，去激活上游的SA。但它可以被视为同源无毒菌株的反应，例如这些携带无毒基因AvrRpt2（Zhou等人。，1998）。

在我们的模型预测中，PAD3编码生物合成的酶或只影响camalexin合成和其他防御反应，不限制丁香假单胞菌调节因子的生长。在这项研究中，我们用基础的克隆的方法地图分离PAD3，发现在玉米基因产物与四的吲哚衍生的代谢物（2,4-dihydroxy-1,4-benzoxazin-3-one合成需要DIBOA）和2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one（丁）中（弗雷等人。，1997）它可以编码一个假定的细胞色素P450单加氧酶。PAD3表达是诱导的病原体而且需要PAD4和PAD1。我们的结果有力表明PAD3是参与camalexin生物合成的酶。因此，camalexin也似乎是一个关键的因素限制了丁香假单胞菌的生长但是对A.十字花科蔬菜的抵制是必须的。

结论

PAD3的位图克隆

为了更深层次的观察PAD3在camalexin合成中的作用，我们决定隔离PAD3。唯一已知的是甲磺酸乙酯引起的PAD3（Glazebrook andausubel，1994；Glazebrook等人。，1997b），所以我们使用位图克隆的方法来克隆基因。glabrous1（GL1）位于附近的3号染色体上的位点（PAD3 Glazebrook和奥苏贝尔，1994）。地图PAD3，我们穿过pad3-2 gl1-1哥伦比亚植物和野生型植物将加入兰茨贝格万寿菊。在F 2代，纯合子GL-1的得分为植物pad3-2如何利用camalexin法。PAD3映射使用切割扩增多态性序列（CAPS）映射技术（科涅奇和奥苏贝尔，1993）测量PAD3和附近的标记之间的重组频率。图1表明PAD3的发现

图1。检测markergl1和PAD3 948染色体之间在研究地图的PAD3染色体上的区域3.

33组重组事件，并标记g4711和pad3among 694染色体检查，共检出31中的事件之间的介绍，表明PAD3是这两个标记之间，3.5 厘摩从GL1和4.5厘摩根从g4711。g4711重组子中，有三组重组事件PAD3和GAPA之间。16推荐binants标记之间的所有mi287，重组在GL1，而不是重组在地对空导弹。因此，PAD3放置GAPA和mi287之间。19 F3家庭，重组atgapa或mi287被标记mi178得分，和一个生成的mi287重组，重组，检测；因此，PAD3必须GAPA和mi178之间cic5h4和cic6b11and YAC克隆的一个BAC克隆t7c18或t11a23。粘粒的COM补充或不补充PAD3分别标有（+）和（—）。PAD3的位置用虚线表示。粘粒pzn22用粗体显示。在g4711（4.5%重组GL1（3.5%）和3号染色体的重新组合）。

PAD3的作用在g4711 camalexin synthesis2421中（4.5%重组GL1（3.5%）和重新组合）的3号染色体上。这个区域的物理图谱被用来确定染色体（YAC）是否含PAD3（利等。，1998）。评分与限制性片段长度多态性标记来表明PAD3 mi287驻留在两个mi178的g4711和GL1，CAPS标记重组GAPA，cic5h4和cic6b11（图1）。德克萨斯农机大学的细菌人工染色体（BAC）文库（Choi等人。，1995）进行筛选，筛选杂交鉴定杂交的BAC mi178 andcic11d3r（图1）。发现BACS，t7c18和t11a23跨越的时间间隔时从cic11d3r到mi178的。一个粘粒文库的酵母菌株的构建进行了cic6b11。BAC的t7c18和t11a23标记”作为杂交探针来识别相应的粘粒载体。这些粘粒利用杂交识别重叠排列成叠连群粘粒。

粘粒含有PAD3通过与不同粘粒和测试转换为camalexin合成满足P.S. PV maculicola es4326感染后转化pad3-2植物鉴定。六粘粒补充，13粘粒不补充。所有六个互补粘粒常见的11 kb的DNA拟南芥的一个截面（图1）。因此，这部分必须包含PAD3。

PAD3编码一个假定的细胞色素P450 monooxygenas

在一个粘粒中，拟南芥的DNA的核苷酸序列测定pzn22。一个BLAST（Altschul等人。，1990）在GenBank数据库中的序列搜索发现的爱好者是相似的细胞色素P450单加氧酶。要确定是否来自PAD3的基因是序列，扩增细胞色素P450序列与野生型，pad3-1，和pad3-2植物。测定和比较，确定在pad3-1和pad3-2植物任何突变的扩增片段的DNA序列。如图2所示，两pad3-1和pad3-2植物突变本区。在pad3-1植物，单碱基缺失导致预测的开放阅读框移码和提前终止

密码子，而在pad3-2植物，有预测的开放阅读框ag-to-a点突变（图2）。DNA片段从野生型，pad3-1扩增，和pad3-2植物方面对应于整个COM实现区域pzn22。DNA测序的片段ments表明没有在这一地区的pad3-1或其他核苷酸的变化存在于pad3-2植物中。因此，我们得出结论，编码假定的细胞色素P450单加氧酶基因的铬必须PAD3。

基因组序列被用来隔离PAD3 cDNAclone，它来自于野生型的cdnaends–聚合酶链反应快速扩增植物（RACE-PCR）。DNA测序的cDNA克隆本身揭示了1.7 kb的全长基因（图2）。从cDNA序列和基因组序列的比较中发现一PAD3基因的构成基序的存在。所编码的蛋白质，其中包括490氨基酸残基，具有富含脯氨酸的基序在nterminus C末端附近和血红素结合基序（图2）。这种蛋白质也具有真核细胞色素P450单加氧酶的结构特征。该pad3-1突变导致翻译停止之前，血红素结合位点和pad3-2突变导致谷氨酸forglycine 176氨基酸替换。在图3所示的DNA凝胶分析结果表明PAD3是一个单拷贝基因。

我们确定的序列（GenBank登录号为PAD3 ab016889）是由D.纳尔逊分配的名称cyp71b15（田纳西大学，MEM PHIS）。CYP71是植物细胞色素P450单加氧酶的一个大家庭。通常情况下，所有成员的CYP家庭分享至少40%的氨基酸序列同一性和分为亚科（A，B，C，等等）组成的链更高的序列同一性（查普尔，1998）。因为历史原因，大型CYP71家族是更广泛，不同亚科成员之间的身份可以低至30%。PAD3分享47~ 61%氨基酸序列与身份功能未知的拟南芥的五细胞色素p450monooxygenases：cyp71b2，cyp71b3，cyp71b4，cyp71b5，和CYP71B7。唯一的家庭成员CYP71其在体内的功能是已知的arecyp71e。它来自于高粱，在dhur Rin生物合成途径中将（Z）- p-hydroxy-phenylacetaldoxime转到p-hydroxymandelonitrile（Bak等人。，1998），和cyp71c1，cyp71c2，cyp71c3，和cyp71c4，来自于玉米（分别把BX4，BX3编制成 Bx5，和BX2，），合成出DIBOA吲哚（弗雷等人。，1997）。PAD3是39%的与cyp71e相似，31~34%与玉米酶相似。

图4显示的PAD3结构和cyp71c蛋白之间的对比。cyp71c酶和PAD3的相似性可能是由一个共同的亲和力的吲哚类化合物导致的，因为camalexin和DIBOA都来自吲哚。鉴于PAD3和细胞色素P450之间这些序列相似性，我们得出：PAD3几乎肯定是一种camalexin生物合成所需的酶。

PAD3诱导表达P.S. maculicola es4326感染和SA处理

如果PAD3 编码成camalexin生物合成的酶，然后PAD3的表达可能触发camalexin积累而引起刺激。为了验证这个想法，我们使用RNA凝胶印迹杂交检测植物的挑战与P. S. maculicola es4326 PAD3的表达。图5显示了在受感染的组织中表达量PAD3的时间过程。对感染的反应，PAD3 mRNA的诱导在感染后12小时（图5），在感染后36小时达到峰值（数据未显示）。PAD3也是由无毒的细菌引起的感染的植物。如图5所示，PAD3 mRNA开始积累少量超过在未感染的对照植物感染3小时后达到高峰，12小时后感染。在以往的工作中，我们发现，camalexin积累相关的12小时内由无毒的细菌感染后，而积累更慢响应的有毒的细菌，达到明显的量的12和24小时后感染（Zhou等人。，1998）。PAD3成绩单积累先于camalexin的准确与仿真后的毒性或无毒菌株感染的观察与PAD3发挥camalexin作用的合成这个想法是一致的。

因为SA对camalexin合成是必要但不充分的，我们测试了SA处理对PAD3表达的影响。如图6所示，PAD3 mRNA量响应SA处理而迅速增加，这表明，即使SA是不足够的camalexin合成激活，但它是足够的PAD3的表达。因此Cama—lexin合成必须除受到额外的控制之外海洋受到PAD3的表达调控。某些突变造成的自发性病变相似金光闪闪的病变成因，如加速细胞死亡（acd2-2）突变，也导致高SA浓度和病变组织camalexin合成（格林伯格等，1994。）。我们发现，PAD3还与acd2-2plant病变组织中表达（图6）。

茉莉酸（JA）是足以激活在某些植物抗毒素的合成，但不激活拟南芥camalexin合成（thomma等人。，1999）。不过，由于JA信号可能是必需的，我们分析过的可能性。纯合子的植物冠菌素在sensitive1（COI1）突变是JA和aremale的不育不敏感（Feys等人。，1994）。对camalexin浓度群体分离的COI1纯合子和野生型植物进行了测定34小时后感染s.maculicola es4326 P.。camalexin浓度（ng／cm2；意味着±SD三到五个重复样品）进行了如下内容：野生型，375±93；COI1纯合子（雄性不育从分离群体的植物），87±19；和coi1homozygotes COI1 / COI1杂合子（可育株的分离群体），489±136的浓度下降的COI1植物camalexin均符合的想法，是在响应由P. S. maculicola es4326感染camalexin合成的活化作用。

图3。PAD3是一个单拷贝基因。

约1.5毫克的DNA酶从拟南芥生态型哥伦比亚装在每个车道和PAD3杂交探针。长度的片段（碱基）被显示在左。

D，引；E，EcoRI；H，HindIII；N。 图2 的核苷酸序列和预测的PAD3氨基酸组成

一个98 bp的内含子是小写字母显示。脯氨酸丰富血红素结合基序显示粗体下划线。突变在pad3-1（单碱基缺失）和pad3-2（G-A过渡）的填充和开放的箭头分别表示。使用正义和反义引物序列杂交探针的PAD3下划线。在2423 PAD3 camalexin合成的作用型植物，测定34小时后感染P. S.maculicola es4326。camalexin浓度（ng／cm2；方法三～五6sd重复样品）如下：野生型，375 6 93；COI1纯合子（雄性不育从分离群体的植物），87 6 19；COI1纯合子和杂合子（COI1 / COI1肥沃的植物从分离群体），489 6 136。下降的在与COI1植物camalexin浓度是一致的这是起作用的camalexin活化的想法在响应P.S. maculicola es4326感染的合成。 PAD3的表达减少PAD1和PAD4突变体

确定的五个基因中的一个垫，（PAD4）是已知的对camalexin合成的调节作用（Zhou等人。，1998）。影响camalexin合成调控的突变可能导致缺陷的病原体诱导PAD3的表达。对于这样的缺陷检测，我们在附言研究了大量的PAD3 mRNA maculicola es4326–感染叶片垫的突变体和野生型植物。如图7所示，我们观察到了PAD3成绩单pad3-1植物积累的缺陷。这可能是由于在编码序列的提前终止密码子，导致转录RNA不稳定（卡伯特森，1999）。有趣的是，在感染的毒力P. S. maculicola es4326，ofpad3 mRNA的表达量在PAD1和PAD4突变体均小于野生型植物（图7A）。然而，在将PAD4-1植物无毒的细菌没有观察到这种下降（图7b），与以往研究结果一样，一致认为在附言maculicola植物感染byavrrpt2含菌株合成方面PAD4突变不影响钙malexin（Zhou等人。，1998）。基于这些结果，最有可能PAD1和PAD4 导致camalexin合成，控制介导的PAD3的mRNA表达量增加对感染的反应与附言maculicola es4326 。

讨论

PAD3的序列分析表明，它编码一个细胞色素P450单加氧酶和性。细胞色素p450monooxygenases弥补一个家族在各种生物，包括细菌，植物，和哺乳动物方面的血红素巯基蛋白。大多数这些蛋白质催化NADPH和O2依赖羟化反应（查普尔，1998）。植物细胞色素P450单加氧酶参与无数的生化途径，包括苯丙生物合成，生物碱，萜类，脂类，和植物生长调节剂，如赤霉素，JA，和油菜素内酯（查普尔，1998）。通过cyp71b5和CYP71B7，我们发现，PAD3对拟南芥细胞色素P450单加氧酶cyp71b2密切相关。然而，这些蛋白质的生化功能没有得到报道。

PAD3分享31至34%的氨基酸序列同一性的玉米细胞色素P450单加氧酶蛋白质编码的BX2（cyp71c4），BX3（cyp71c2），BX4（cyp71c1），和Bx5（cyp71c3）（图4）。这些基因在酵母中的表达显示，他们中的每一步催化氧化吲哚和DIBOA之间在丁布的生物合成途径（弗雷等人。，1997）。丁布和其前体，DIBOA，被认为玉米抗病和抗病性相关（迈耶，1988）。BX1系列基因编码色氨酸合成酶同源，似乎提供DIBOA合成吲哚（Frey，等。1997；Melanson等人。，1997）。据推测，这是因为与色氨酸合成酶紧密相关，在植物活性和吲哚立即转换不用从酶复合物释放的色氨酸。在一起，这些五Bx的基因构成一个分支通路，将吲哚DIBOA而不是胰酶消化离心（弗雷等人。，1997）。像DIBOA，camalexin， anindole也衍生物；因此，序列之间的相似性，DIBOA细胞色素P450单加氧酶和PAD3表明PAD3 camalexin生物合成功能研究。吲哚是camalexin的前体，和一个arabi—dopsis序列有80%的同源性拟南芥色氨酸合成酶已确定；因此，Arabi—dopsis也可能有这样总有提供 BX1系列吲哚camalexin合成活性（祖克，1998）。在拟南芥和玉米的进化中，其具有保护作用的次生代谢产物合成类似的途径的可能。

大多数的细胞色素P450单加氧酶催化氧和NADPH依赖性的羟基化反应。camalexin不含氧原子，所以一个细胞细胞色素P450酶camalexin合成的作用不是很明显。然而，这一发现，吲哚和半胱氨酸前体的camalexin（祖克和哈默施密特，1997；祖克，1998）是一个用于camalexin生物合成，其开始与吲哚-3-甲醛和半胱氨酸冷凝途径相一致（Browne

等人。，1991；祖克，1998）。细胞色素P450单加氧酶和编码PAD3可以从吲哚参与吲哚-3-甲醛的合成。

除了camalexin合成色氨酸途径，导致许多二手麦太保精英的生物合成，包括生长素吲哚乙酸和吲哚硫代葡萄糖苷（拉德文斯基最后，1995）。这些植物次生代谢产物的重要性是提出需要的监管机制，控制在色氨酸途径的代谢流体生产满足这些不同的次生代谢物的生物合成。去年（1996）赵指出，该酶参与色氨酸生物合成的论文和camalexin合成大量的协同调控。通过色氨酸代谢途径酶和camalexin积累的病原体和诱导子处理感染诱导活性（赵，1996）。另一方面，因为在TRP基因突变并没有主要引起camalexin积累（赵，1996），通过色氨酸生物合成途径通量明显地不率camalexin合成的限制。

我们已证明在PAD3 转脚本的积累与之前，camalexin富集后感染P.S. maculicola es4326或es4326携带AvrRpt2与植物相关acd2-2 camalexin合成。然而，SA虽然可激活表达PAD3，但SA处理不足以激活合成camalexin。显然，camalexin合成一部分是通过控制生物合成酶的表达和一部分由一个未知的机制调节来合成的。

camalexin合成控制在mRNA水平，在观察应对致命的附言maculicola es4326 PAD3 mRNA的积累大大降低模拟PAD1和pad4mutants后，表明PAD3表达参与PAD1和PAD4，这一想法取得了人们的支持。我们发现PAD3的表达需要PAD1和PAD4是符合我们的模型，因为它预言PAD1和PAD4应该控制camalexin合成以及其他的防御反应。以前的工作表明，PAD4编码一种调节因子，需要促进对P.S. maculicola es4326感染SA合成（Zhou等人。，1998）。我们现在发现PAD3表达增强SA处理。因此，对生产PAD3、camalexin合成的需求是期待的，PAD4作用很可能是SA的介导。

我们发现PAD1是PAD3表达，这表明PAD1具有调控基因的作用及要求。PR-1是PAD1突变体通常表示（J. Glazebrook，未发表数据）；因此，PAD1是联合国可能影响SA的信号。但是，对影响camalexin合成，PAD1可能会由JA依赖的信号转导通路介导的。这条通路（creelmanand乌鱼，1997），从而导致植物的fensin基因PDF1.2感应，抗真菌和卵菌是重要的（penninckx等人。，1996；保龄球等人。，1997；thomma等人。，1998）。对于PAD1植物，响应于A.十字花科蔬菜感染PDF1.2表达减弱（thomma等人。，1999）。有趣的是，COI1突变体在响应于P.S. maculicola es4326感染camalexin生产缺陷，符合的想法，camalexin生物合成激活需要JA信号转导通路的组件。奇怪的是，COI1不锁定camalexin合成反应A.十字花科蔬菜感染（thomma等人。，1999），这表明camalexin合成可以通过不同的机制调控对不同病原菌。显然，需要更多的实验来探讨JA的活动条件才可能让camalexin合成发挥作用。

因为PAD3是正常表达PAD2和PAD 5突变体，在这些植物camalexin合成缺陷必定有一些其他的原因；例如，PAD2或PAD 5可能是调节其他camalexin生物合成的酶的编码基因。基于增强敏感性的PAD2亩活性P.S. maculicola es4326，我们的模型预测影响一个调节因子的pad2影响camalexin合成和一些其他的防御反应，限制对P.S. maculicola es4326。如果是这样的话， PAD3表达机制的调节作用必定会发生，而不是它的控制调节作用。PAD 5突变不影响P. S. maculicola es4326生长；因此，我们预测，PAD 5编码另一种生物合成的酶或影响Cama—lexin合成的调节而不影响需限制P.S. maculicola es4326生长的防御反应。其他PAD基因的克隆鉴定应该帮助解决这些问题。

几乎可以肯定，PAD3编码camalexin生物合成和PAD3的突变导致疾病易感性做的病原菌丁香假单胞菌霉事实（Glazebrook和奥苏贝尔，1994）这表明，camalexin不在植物抗病性中发挥了重要作用，细菌感染。有了这种想法，cama-lexin是丁香假单胞菌有毒的浓度比在受感染的植物的浓度高得多，丁香假单胞菌 es4326抗性camalexin突变体并不是比野生型细菌更具有毒力（Rogers等人。，1996）。虽然其他的宿主防御反应增强，pad3突变体这种代偿性刺激的Al半夏防御反应可能会降低制约植保素合成的突变体的影响，如果可能的话，到目前为止没有发现这种补偿性的防御反应。

PAD3对病原真菌增强了灵敏度。A.十字花科蔬菜表明了camalexin抵抗一些真菌病原体的作用（thomma等人。，1998）。我们的结论表明PR-1，病程相关蛋白的表达与PAD3编码的生物合成的酶的一致，并在响应于A.十字花科蔬菜素未在PAD3的植物（thomma等人。，1999）。因此，PAD3植物唯一的缺陷可能涉及camalexin合成。所以，camalexin似乎是导致耐A.十字花科蔬菜的重要因素，以及camalexin浓度的改变可能会产生对其他病原真菌的戏剧效果。

理论

种植及成长条件

植物（拟南芥哥伦比亚生态型）的pad3-1，pad3-2，和acd2-2突变先前已经描述了（Glazebrook和奥苏贝尔，1994；格林伯格等人。，1994；glazebrooket Al。，1997b）。植物在地铁和200土壤盆栽（斯科特塞拉利昂园艺产品，马里斯

维尔，OH）在机房（23±2℃在15至50%的湿度）或在生长室（22±2℃在85%的相对性湿度）在12小时的光/暗周期12小时。完全展开叶的4-week-oldplants被用于所有的实验。

细菌接种

先前已经描述了丁香假单胞菌PV maculicola es4326（Dong等人。，1991）及先前所描述的无毒基因AvrRpt2被进行质粒plh12（Dong等人。，1991；惠伦等人。，1991）。丁香假单胞菌菌株在国王的B中添加适当的抗生素生长（Glazebrook andausubel，1994）。细菌渗入先前所描述的拟南芥（Glazebrook和奥苏贝尔，1994）。除非另有说明，为体育syringaes camalexin实验，培养细菌的剂量为3×10000菌落形成单位每平方厘米叶面积。涉及从被感染的叶片总RNA提取实验，菌株P.S. maculicola es4326和P. s.maculicola es4326携带AvrRpt2在剂量10000集落形成每平方厘米叶面积单元引入。

camalexin测定

camalexin化验如以前所说的进行（glazebrookand奥苏贝尔，1994）

DAN的准备

从冰冻的叶组织中分离株的基因组DNA样品，按照标准程序（dellaporta等人。，1983）。酵母人工染色体携带适当酵母培养（YAC）克隆在AHC 5毫升培养基生长在30℃ untillate对数期。用1 M山梨糖醇洗后，细胞颗粒在1 M山梨糖醇溶液悬浮，10毫米EDTA，柠檬酸100 mmsodium，pH值5.8，和30毫米-巯基乙醇，然后在cubated 10毫克/毫升在30℃ 1小时溶壁酶。萃取的DNA300L溶液含有50 mmtris，20毫米EDTA，pH值7.5，和1%的SDS在65℃ 30分钟，30分钟，250L 5 mpotassium醋酸和培养对冰的加入后，DNA在苏pernatant是500L异丙醇沉淀，治疗的能力，提取50:50（体积/体积）苯酚：氯仿和乙醇沉淀，悬浮。酵母DNA总收率1克/毫升。此过程被放大以获得大量的酵母DNA克隆。细菌人工染色体（BAC）的DNA是利用拟南芥的生物资源中心提供的协议纯化（哥伦布）。

粘粒文库的建设

从YAC克隆cic6b11酵母DNA的部分消化和TaqI蔗糖梯度分离。馏分含有19到22 kb的片段被克隆和消化pcld04541（bentet等人。，1994）利用千兆包II黄金包装前道包装（Stratagene，La Jolla，CA）。

从YAC和BAC探针生成结束

获得的右端（cic11d3r）从YAC cic11d3，我们消化200 ng与hincii酵母DNA和用DNA聚合酶的Klenow片段我跟着T4 DNA连接酶。逆聚合酶链反应（PCR）进行了引物与杂交的 pYAC4向量（GenBank登录numberu01086）：P8，5- tctgggaagtgaatggag-3；和P13，5- tgg-gctgcttcctaatgca-3。BAC末端t7c18和t11a23所使用的连接协议的修改后的版本得到（西伯特等人。，1995）。11地高辛标记探针进行原位，根据供应商的指示（勃林格曼海姆）。

移植

质粒导入根癌农杆菌gv3101pmp90（孔茨和谢尔，1986）在大肠杆菌MM294重组辅助应变压力ENCE三亲交配。植物的贝克托尔德等人的方法转化。（1993），但0.005%的Silwet L-77（lehle种子，围岩，TX）加入菌悬液，真空步骤被省略。反共振峰的含0.5×Murashige andskoog盐板选择（生命技术，盖瑟斯堡，MD），1×gamborg'sb5维生素（σ），和50g/ml卡那霉。

DAN测序

含PAD3粘粒DNA经HindIII和亚克隆在质粒II SK+（Stratagene）。DNA测序每使用标准的染料终止序列程序和自动测序仪（373和377形成模型；应用BIOSYS电信设备制造商，福斯特城，加利福尼亚）

cDAN的分离

通过使用一个马拉松的cDNA扩大倍数试剂盒获得PAD3 cDNA（Clontech公司，帕洛阿尔托，CA）和mRNA从野生型植株感染P. S. maculicola es4326准备。5′快速扩增cDNA基因的特异性引物末端（RACE）–PCR为5′- gctctctcttccaggcttaagatgctcg-3′；3′RACE-PCR，这5′- ctgagtttgctacgagacaatctccggtg-3′。用引物对5′和3′竞赛产品的末端互补进行端到端的扩增获得全长双链cDNA：5′- ccttcgaaatataagcttcctccgggtcc-3′和5′- ggcttcctcctgcttcgccaatccccaatc-3′。

RNA凝胶印迹分析

准备介绍以前RNA凝胶印迹的5克每车道总RNA（Zhou等人。，1998）。的PAD3探头是由pzn22粘粒DNA的引物5′感- ccggtgaatcttgagagagcc-3′和反义引物5′- gat-cagctcggtcattcccc-3′PCR扩增；PCR与digoxygen in-11-dutp

反义单链DNA标签。印迹被剥夺和实验组与18S rRNA探针评估等载荷均样品（Zhou等人，1998）

感言

我们感谢戴维布雪（INRA，凡尔赛宫，法国）好心提供3号染色体的物理图谱，在出版之前，Johnturner（东安格利亚大学，英国）的COI1种子的礼物，Willembroekaert（比利时鲁汶大学，比利时）的未发表的数据通信，戴维纳尔逊（田纳西大学，孟菲斯）和细胞色素P450单加氧酶分类和帮助，克林特查布（普渡大学，西拉斐特，在）和威廉Broekaert有益的讨论和批判性阅读的手稿。我们也感谢拟南芥的生物资源中心提供BAC文库的过滤器，YAC和BAC克隆，并重新限制片段长度多态性标记。这项研究得到了由马里兰大学生物技术学院授予人的启动资金和来自于批准号为MCB 9723493的国家科学基金会。

于1999年7月14日1999年10月6日接受。

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DOI 10.1105/tpc.11.12.2419

《植物细胞》1999年12月第2419—2428期第11卷

周楠、媂娜L.图特和简·格雷兹布鲁克

对于camalexin生物合成所需的arabidopsisa PAD3基因，编码一个假定的细胞色素P450单加氧酶，

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