我院制剂的微生物限度检查方法学验证

2011年 第 13 卷 第 12 期（总第98期）

2197我院制剂的微生物限度检查方法学验证

费嘉1,张儒1,刘辉2

(1北京军区总医院药剂科,北京 100700;2北京军区总医院第二干部病房,北京 100700)

【摘要】目的:应用微生物验证试验建立我院制剂的微生物限度检查方法。方法:按照药典方法对我院自制制剂进行微生物验证试验,并对其结果进行探讨。结果:大多数我院制剂可以用常规方法进行微生物检查,但对于有部分抑菌作用的制剂,我们采取了不同的方法进行验证,确立了微生物试验的方法。结论:由于制剂中所含有的成分不同,其抑菌作用也不相同,为了真实反映制剂的微生物情况,保证微生物检验方法的可靠性,必须对制剂进行微生物试验方法学验证。【关键词】微生物限度检查;方法学验证;医院制剂;抑菌作用

【中图分类号】R286.0　【文献标识码】 A　【文章编号】1009-0959(2011)12-2197-03

Valitation Method for Microbial Limit Test of Drugs

Fei Jia1, Zhang Ru1, Liu Hui2

(1Pharmacy Department of Beijing Command General Hospital, Beijing 100700;2

The Second Cadres Ward of Beijing Command General Hospital, Beijing 100700,China)

【ABSTRACT】Objective: To establish the method of microbial limit test of the drugs, by the valitation method for microbial limit test. Method: According to the method described in the Pharmacapeia of China 2005, the valitation test was held on the hospital’s preparations, and the results were discussed. Results: Most of the preparations could do the microbial limit test in a normal way, but some preparations with bacteriostasis sould take other methods to establish the microbial limit test. Conclusion: It is necessary to establish a valitation method for microbial limit test of the preparations to reflact the real microbial situation, because the bacreriostasis of the preparation is different with the compositions.

【KEY WORDS】 Microbial Limit Test; Valitation; Hospital Preparations; Bacteriostasis

微生物限度检查就是考察非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染的程度,检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度的检查易受到工作环境,样品性质以及试验方法的影响,因此任何药品在进行微生物限度检查时,首先应进行方法学的验证,保证所采用的检查方法适合于样品的微生物限度检查。尤其是药品中含有抑菌活性成分时,应保证在检验条件下的供试品不足以抑制微生物的生长,从而保证检查方法的准确性。2005年版《中国药典》附录中增加了微生物限度检查方法学验证的要求。方法学验证要求针对细菌、霉菌、酵母菌计数方法和控制菌的检查方法进行验证。并且,验证包括初次验证,即建立微生物限度检查法时进行的验证,和再次验证,即当药品的组分或原检验条件发生改变,可能影响检验结果时,计数方法应重新验证。本文以本院制剂的方法学验证简单介绍验证的过程。

1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

验证试验需至少进行3次独立的平行试验,分别计算各试验菌每次试验的回收率。验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌,菌种要求不得超过5代,菌液制备为50－100cfu/ml。其中大肠埃希菌代表革兰氏阴性菌,金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性菌,枯草芽孢杆菌代表芽孢,白色念珠菌代表酵母菌,黑曲霉代表霉菌。1.1 样品

板蓝根颗粒(无糖和有糖),川贝枇杷糖浆,复方鳖甲软肝胶囊,感冒清热颗粒,金果含片,金水宝胶囊,七宝美髯颗粒,双黄连颗粒,抗骨增生胶囊,六味地黄胶囊,血塞通滴丸,养阴清肺糖浆,银黄颗粒,茵栀黄颗粒,枸橼酸钾溶液,百亚合剂,炉甘石洗剂,硫酸镁溶液。以上均为我院自制制剂,包括中药和万方数据化学药,口服制剂和外用制剂。1.2 菌株

本实验所用菌株均来自北京军区药检所。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003] 3代,大肠埃希菌(Escherichia Coli)[CMCC(B)44102] 3代,枯草芽孢杆菌(Bacillus Sulticis)[CMCC(B)63501] 3代,白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001] 3代,黑曲霉(Aspeigillus niger)[CMCC(F)98003] 2代。1.3 试验方法

按2005年版中国药典附录微生物限度检查法,有关微生物限度检查法方法验证试验。

1.3.1 菌液制备 分别取经35℃培养18~24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物10倍稀释至10~5 ~10~7,菌数约为50~100 cfu/ml,做计数备用。

取经25 ℃培养24~48小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml加9 ml 0.9 %无菌氯化钠溶液,10倍稀释至10~5,菌数约为50~100cfu/ml,做计数备用。

取经25 ℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物,加3~5ml 0.9 %无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子,吸取出菌液, 用标准比浊管比浊后,取菌液1ml加9 ml 0.9 %无菌氯化钠溶液,10倍稀释至10~4,菌数约为50~100cfu/ml,做计数备用。1.3.2供试液制备 依据2005年版《中国药典》对供试品进行制备。取样品10 g或10 ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml,混匀,制成1:10供试液,备用。

1.3.3 回收率测定 根据供试品的理化性质,选择合适的方法设立实验组,菌液组,供试品对照组和稀释剂对照组。

(1) 试验组:平皿法计数时,取1:10供试液、50~100cfu/ml的试验菌株各1ml分别加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待

2198 Chinese Journal of Medicinal Guide2011 Volume 13 No.12 (Serial No.98)

凝固后,置规定温度培养24~72小时观察结果。每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时,取1:10的供试液1 ml,过滤,冲洗,在最后一次冲洗液中加入50~100cfu的试验菌,每株试验菌平行制备2个薄膜,按薄膜过滤法测定其菌数。

(2) 菌液组:取规定量的试验菌株加入平皿中,测定每一菌株的试验菌数。

(3) 供试品对照组:取规定量的供试液按照试验组的检查方法检查,测定供试品本底菌数。

(4) 稀释剂对照组:用稀释剂代替供试液,并加入试验菌,使最终菌浓度为50~100 cfu/ml,按照供试液的制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

(5)阴性对照组:用稀释剂代替供试液,加入平皿中并测定其菌数。试验结果

3 次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数) 和试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分数) 均应不低于 70 %。若不符合该标准要求,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法学验证。结果见表 1。结果

在我院19个制剂中,全部药品的霉菌及酵母菌的计数可用常规方法直接测定;大部分药品的细菌计数可采用常规方法测定,对于部分药品如:金果含片、双黄连颗粒、六味

表1 试验菌计数方法验证结果(%)

样品名称板蓝根颗粒(无糖)板蓝根颗粒(有糖)川贝枇杷糖浆复方鳖甲软肝胶囊感冒清热颗粒金果含片金水宝胶囊七宝美髯颗粒双黄连颗粒

试验方法平皿法平皿法平皿法平皿法平皿法平皿法

离心沉淀集菌法

平皿法平皿法平皿法薄膜过滤法

培养基稀释法(0.2ml/皿)

离心沉淀集菌法

平皿法平皿法

离心沉淀集菌法

平皿法

离心沉淀集菌法培养基稀释法(0.2ml/皿)

平皿法平皿法平皿法薄膜过滤法

培养基稀释法(0.1ml/皿)

平皿法平皿法平皿法平皿法

金黄色葡萄球菌

86.010095.079.678.710091.494.777.8010083.510010095.510084.910010087.293.6010010088.596.8100100

地黄胶囊,血塞通滴丸、茵栀黄颗粒等对细菌有一定的抑菌作用,我们采用了薄膜过滤法、培养基稀释法以及离心集菌法等方法消除其抑菌作用,测定回收率,其回收率均大于70 %。在采用这些方法的同时,为了考察在供试液制备过程中微生物受影响的程度,使用了稀释剂对照组,稀释剂对照组的菌落回收率均大于70%。2 控制菌检查的方法验证

2000版微生物限度标准中细菌、酵母菌和霉菌的计数法按剂型制订,控制菌检查则按给药途径制订,而2005版均按给药途径制订,统一了标准。根据制剂的给药途径以及所含有的成分不同,控制菌的检查项目均不相同。2.1菌株

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003],大肠埃希菌(Escherichia Coli)[CMCC(B) 44102],乙型付伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)[CMCC(B) 50094],铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]。2.2试验方法

本院19个制剂,按照2005年版中国药典附录微生物限度检查法,有关控制菌检查方法验证试验。

2.2.1菌液及供试液的制备菌液制备 分别取35℃培养18~24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌营养肉汤培养物1ml加9ml 0.9 %无菌氯化钠溶液,10倍稀释至10~5 ~10~7,菌数约为10~100 cfu/ml,备用。

供试液制备同计数方法的验证试验。

2.2.2验证方法 根据供试品的理化性质,选择合适的方法设立试验组,阴性菌对照组,阴性对照组。

抗骨增生胶囊六味地黄胶囊血塞通滴丸

养阴清肺糖浆银黄颗粒茵栀黄颗粒

枸橼酸钾溶液百亚合剂炉甘石洗剂硫酸镁溶液

大肠埃希菌

1001001001001005882.110010078.610010010082.06282.710010010010090.672.810010010010010093.4枯草芽孢杆菌

10010010093.110010010087.877.90无法计数43.110075.610010057.486.776.510073.016.7无法计数10010010010084.1

白色念珠菌

10010010083.8100100

91.3100100

黑曲霉70.981.290.010074.5100100100100

10076.487.7

100100100

91.310098.682.8100100

10010010010010076.484.880.9

稀释剂组

-*----->85---100>90>80-->80->80>80---100>90----

　　*注:- 表示稀释剂组与菌液组相同,不再重复计数。

万方数据中国医药导刊

2011年 第 13 卷 第 12 期（总第98期）

2199(1)试验组:取规定量的供试液以及10~100cfu/ml的试验菌各1ml加入增菌培养基中,置规定温度培养,依照相应控制菌检查法进行检查。采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤、冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后注入增菌培养基或取出滤膜加入增菌培养基中。

(2)阴性菌对照组:在验证大肠埃希菌、大肠菌群、乙型付伤寒沙门菌时,采用金黄色葡萄球菌为阴性对照菌;验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时,采用大肠埃希菌为阴性对照菌,检查方法同试验组。

阴性对照组:取稀释液10 ml,检查方法同试验组。2.3试验结果

阴性菌对照组应不得检出阴性菌,阴性对照组应无菌生长。试验菌组应检出试验菌,若未检出,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新验证。结果见表2。

表2 控制菌检查法验证结果

样品名称板蓝根颗粒(无糖)板蓝根颗粒(有糖)川贝枇杷糖浆复方鳖甲软肝胶囊感冒清热颗粒金果含片金水宝胶囊七宝美髯颗粒双黄连颗粒抗骨增生胶囊六味地黄胶囊血塞通滴丸养阴清肺糖浆银黄颗粒茵栀黄颗粒枸橼酸钾溶液百亚合剂炉甘石洗剂硫酸镁溶液

控制菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌

大肠埃希菌、大肠菌群、乙型付伤寒沙门菌

大肠埃希菌大肠埃希菌

大肠埃希菌、大肠菌群、乙型付伤寒沙门菌

大肠埃希菌大肠埃希菌

大肠埃希菌、大肠菌群

大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌

大肠埃希菌

试验方法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法常规法

部分制剂本身具有抑菌或杀菌作用,所制备的供试液本身具有影响微生物生长的作用,若不经方法学验证,难以保证所采用方法的适合该供试品的微生物限度检查,难以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

微生物限度检查验证试验中,细菌、霉菌及酵母菌计数最为关键的步骤是回收率的测定,其中菌液的制备尤为重要。菌液制备要求每1ml菌液中含有50~100 cfu的菌,以减少操作误差,含菌数过多或过少,在回收率测定时误差都会增大。制备的菌液放置时间不宜过长,否则菌体的生理状态发生变化,影响回收率的测定。

当供试液无法达到测定回收率的要求时,应根据样品的物理或化学性质选择消除供试品抑菌成分的方法,如中和法、培养基稀释法、离心法、薄膜过滤法或多个方法联合使用。供试液的制备时间不宜太长。离心法可根据样品抑菌成分的溶解性和抑菌强弱选择不同的离心转速,通常采用3000转/分离心20分钟,弃去上清,底部留2 ml菌液,再用稀释液稀释至原量,基本可以达到集菌的作用;采用中和法时 ,可参考药典选择适宜的中和剂。若中和剂和乳化剂同时使用时,应确认它们的相溶性、能否有效去除抑菌成分及对微生物生长和存活无影响。此时,均需要增加稀释剂组,考察供试液的制备方法对微生物的生长影响的程度。

微生物检验是活体试验,许多因素均会影响试验结果。例如,培养基以及培养条件,对于含有抑菌成分的药品,培养基是在确定条件下计数准确性的最关键的因素。每次验证试验的条件应一致,以保证试验的可重复性。同时,检验的条件也应与验证的条件保持一致,以保证检验的可靠性。

总之微生物限度检查方法学验证,保证了检验方法的准确、可靠,保证了微生物限度检查时所采用的方法是适合于该供试品的。因此,方法学的验证是重要的也是必需的。

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　　以上19个制剂控制菌检查均可使用常规法进行检查。除炉甘石洗剂外均是口服制剂,控制菌检查项为大肠埃希菌,炉甘石洗剂为外用洗剂,控制菌检查项为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。口服制剂中含有药材原粉的有复方鳖甲软肝胶囊、抗骨增生胶囊以及含有发酵成分的金水宝胶囊,控制菌检查项还要检查大肠菌群。含有动物组织或动物类原药材粉的制剂如金水宝胶囊和复方鳖甲软肝胶囊,控制菌还需要检查沙门菌。 3 结论

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万方数据