奶粉中蛋白质含量测定

朱文轩 B09070116

前言：在许多蛋白质研究的领域中，用一种快速准确的方法来检测蛋白浓度是必不可少的。一种新建立的考马斯亮蓝法在许多实验中已成为首选方法用来定量的检测蛋白浓度。与传统的Lowry法相比，该 法更易操作，更快，更灵敏，此外，它受其他一些试剂和非蛋白成分干扰也较小。该考马斯亮蓝法其检测原理是基于染料考马斯蓝G250和蛋白质之间形成的特异性结合。详细的研究表明[1]，该染料可以自由存在于四种不同的离子形式中。相比之下，染料更多的阴离子形式与蛋白质结合且结合后显蓝色，在590 nm左右具有最大吸收。因此通过定量测定染料的蓝色离子的量就可以算出蛋白质的量，这通常可以在595 nm处测定吸光度获得。 实验部分： 实验流程图：

前期原料配备 标准曲线绘制 样品测定

实验过程：1、称取奶粉样品，配制成5mg/ml的溶液。取0.3ml该溶液于试管，再加入0.7ml去离子水，9ml考马斯亮蓝G-250，配制成奶粉含量为150μg/ml的样品溶液。

2、配制的标准牛血清蛋白（BSA）溶液为0.4mg/ml,选用五个点绘制标准曲线，五点BSA溶液体积分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml，相应的加入9ml考马斯亮蓝G-250，和水，每份配制成体积为10ml的溶液，即每份含BSA量为40，80，160，240，320μg。浓度为4，8，16，24，32μg/ml。配制两组相同的分别为A1组和A2组。表格如下： 0 1 0.1 2 0.2 3 0.4 4 0.6 5 0.8 标准牛血清蛋白0 （BSA）/ml 去离子水/ml 1 0.9 9 0.8 9 0.6 9 0.4 9 0.2 9 考马斯亮蓝9 G-250/ml 3、做紫外分光光度测试，得每份试剂蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收A。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

4、根据所测数据通过作图得直线A=aC+d(A为蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收,C为溶液浓度)。再对样品做紫外分光光度测试，得其最大光吸收A'，则样品中蛋白质浓度为C'=（A'－d）/a。固样品蛋白质含量计算公式为10C'/1500×100%。

主要试剂和仪器：

考马斯亮蓝G-250，去离子水，标准牛血清蛋白（BSA） 移液管20ml两支，50ml一支，紫外分光光度仪，15个25ml比色管，石英比色皿一对。 实验结果与数据分析：

每份试剂蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收A，表格如下： 1 2 0.169 0.208 3 0.340 0.317 4 0.688 0.613 5 0.839 0.836

样品中蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收A'，表格如下： A'/ L·g-1·cm-1

数据处理得标准曲线：

1 0.380 2 0.451 3 0.457 平均 0.429 A1/ L·g-1·cm-1 0.092 A2/ L·g-1·cm-1 0.083 平均 0.0875 0.1885 0.3285 0.6505 0.8375

根据公式C'=（A'－d）/a得C'=17.175μg/ml

根据公式10C'/1500×100%得样品蛋白质含量为11.46%。 参考文献：

［1］Zuo,S.-S.and Lundahl,P.A micro-Bradford membrane pro- tein assay[J].Analyt.Biochem,2005,284:162-164.

[2]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版 社, 1997: 72-81.

[3]许家喜.蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定 [J].大学化学, 2009, 24(1): 66-69

实验设计总结：1、由于移液管操作的不熟练，造成配制溶液时出现一些偏差，标准曲线中有个点误差太大，曲线拟合度做得不是很好。要多练习移液操作。

2、蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，

完成反应十分迅速。但其结合物在室温下只能1h内保持稳定。 3、经过此次实验，对紫外分光光度仪使用更加熟练。 4、误差分析：（1）比色管没洗干净，有残留水和乙醇

（2）移液操作出现误差 （3）做平行实验时取液不准确