大肠杆菌的转化与培养

大肠杆菌的转化与培养

大肠杆菌的转化与培养

原理

质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

实验器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)，制冰机，恒温摇床，培养皿(已铺好固体LB-Amp)，超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

培养基及试剂

培养基(不加抗菌素)，LB培养基(加抗菌素)，无菌ddH2O，IPTG，X-gal.

实验准备

无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)，20%IPTG(M/V)，2% X-gal(M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配)。

操作步骤

(1)事先将恒温水浴的温度调到42℃。

(2)从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。

(3) 加入5μl连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng)，轻轻震荡后放置冰上20min。

(4) 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。

(5) 在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.

(6) 在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂)。

(7) 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

(8) 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

(9) 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

(10)观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。