RIP实验技术

【实验技巧】RIP实验技术 RIP实验技术 近年来，长非编码RNA（lncRNA）得到了研究界的广泛关注。如今，人们已经鉴定了大量lncRNA，但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题，研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究，并为此开发出了越来越多的分析工具。 下面我们来介绍一下RIP技术。 RNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP（RNA immunoprecipitation），可以说是RNA版的ChIP（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。 在RIP试剂盒（如Sigma的Imprint? RNA Immunoprecipitation kit）的帮助下，研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA，再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。 不论是细胞质还是细胞核，都会发生RNA与蛋白的相互作用。据Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp介绍，该公司的RNA ChIP-IT? kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作，随后对染色质进行超声，并用DNAse I处理，最后利用磁珠进行沉淀。 “如你研究的是总mRNA，那么常规RIP试剂盒更合适一些，”Hondorp说，“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。” 生产Magna RIP? RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司，

也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布，该产品有化学交联与native两种形式。据介绍，化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是，亲和力更高也更为直接的相互作用。

除RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化，不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化（如凝胶电泳片段分离），还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP 技术——iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），该技术能够以单个碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息。

据伦敦大学学院的Jernej Ule教授介绍，CLIP与RIP的关键性差异，在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记，并将这些复合物进行SDS-PAGE分离，之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性，减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来，用于制备cDNA文库，以备测序分析。

“CLIP要比RIP麻烦一些，不过我认为它很值得采用，”Ule说。“放射性信号的量及其特异性，能够帮助我们提高cDNA文库的质量，最终得到准确实用的数据。”

一. 细胞裂解液获取

A. 单层细胞或者贴壁细胞处理

1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次

2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管

3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min

5. 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃

B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解

C. 组织样品处理

1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次

2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数

3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞

4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min

5. 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃

二. 磁珠的准备

A. 实验前准备

1、enpendoff管

2、磁力架

3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上

4、抗体，置于冰上

5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水

B. 磁珠准备过程

1. 重悬磁珠

2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照

3. 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管

4. 每管加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡

5. 将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次

6. 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中

7. 室温孵育30min

8. 将enpendoff管置于磁力架上，弃上清

9. 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次

10. 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上

三. RNA结合蛋白免疫沉淀

A. 准备工作

1、冰盒

2、360°旋转仪

3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上

B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程

1. 准备RIP Immunoprecipitation Buffer

2. 将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer

3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml

4. 4℃孵育3h至过夜

5. 短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清

6. 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次

四、RNA纯化

A. 实验前准备

1. 枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶

2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上

3.RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇

4.DEPC水置于冰上

5. 离心机预冷

6. 冰盒

B. RNA纯化过程

1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul

2.用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物

3. 55℃孵育30min

4. 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中

5. 于每管上清液中加入250μlRIP Wash Buffer

6. 于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min

7. 小心的吸取350μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管

8. 于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min

9. 小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管

10. 每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer 无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜

11. 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清

12. 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.

13. 10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存，送测序

1：RIP试验需要注意什么?

(1)防止RNA与蛋白非特异性结合。

(2)避免RNA蛋白质结合被破坏。

(3)避免外源RNAse污染。

(4)抑制内源RNase的活性。

，850μl

(5)选择适合做RIP的抗体。

(6)避免RNA结合蛋白的降解。

2：为什么抗体无法沉淀RIP裂解液中的目标蛋白?

(1)先进行IP或者WB，测试抗体可以与目标RBP结合。

(2)另选一个能与抗原其他表位结合的抗体。

(3)尽可能选用密理博RIPAb+抗体。

(4)稀释抗体成浓度梯度，进行IP测试。

(5)4℃过夜孵育抗体与RIP裂解液。

(6)确定抗体类型与Protein A/Protein G匹配。

3：提取RNA时，蛋白酶k消化不完全是什么原因?

当进行蛋白酶K消化时，确保水浴温度应设置在55℃左右，长期在65℃以上孵育会导致蛋白酶K失活。

4：提取RNA后，A260/A280比值偏离1.8~2.2区域是什么原因?

(1)需要缩短酚氯仿提取RNA的时间间隔。

(2)测试提纯后RNA中是否存在RNA酶，可能RNA发生了降解。

5：做RIP的时候和beads孵育的lysate的浓度如何确定?有些动物的文献提到用细胞板数细胞个数，想知道如果用蛋白浓度的话，大概在什么数量范围的蛋白总量对应50 ul BEADS?

50 ul beads对应的是一个reaction，而我们推荐一个reaction是100ul裂解上清(2×107 cells加入100ul RIP lysis buffer得到)，所以只需要在裂解前计数一下，并按括号中的比例加入裂解buffer，后续100 ul 裂解上清就是一个reaction的蛋白用量。不建议通过裂解后测蛋白浓度的方法进行配比。

6：RIP可以分提核浆的RNA-蛋白质复合物吗?

理论上，可以采用能分别抽提核浆蛋白的蛋白抽提kit先分离样本，再进行RIP实验。但需要特别注意的是所用kit中的reagent不能有RNase和DNase，以及要能与下游的抗体beads孵育兼容。

7：因为RIP做完得到的是RNA序列，要做后续检测，比如测序、判断目标序列位置等，是不是都必须要做RT-PCR，得到逆转录的DNA后，后面就跟ChIP相同了?

常见的用real time qRT-PCR。如果对照的目的是保证两个样品间加入的细胞量一致或者进行定量，理论上说，使用input作为判别，计算不同样品上样量的差异。如果对照的目的是为了看IgG以及目的抗体富集的非特异性mRNA的量的话，那么可以找一个确定不会与目的抗体结合的RNA片段设计primer进行qPCR，用来看IgG以及目的抗体拉下来的背景情况。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等)