各种同工酶的染色方法
一、淀粉酶
⑴、制胶方法：
分离胶（6%）：
分离胶贮液：2.95 mL
Tris-柠檬酸（pH8.9）：10.95 mL
2%Na2SO4：0.4 mL
1%过硫酸铵：0.4 mL
TEMED：20 μL
配制方法：
分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis贮液）：30 g Acr + 0.8 g Bis加重蒸水50 mL（可加热溶解）定溶至1000 mL（pH 4.8～5.1，冰箱内可放置2～3个月）
→1
Tris-柠檬酸（pH8.9）：15.5 g Tris + 1 g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）加重蒸水溶解，调pH至8.9（用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调），最终定溶至1000 mL，滤纸过滤后置冰箱中保存。
2%Na2SO4：1 g Na2SO4加重蒸水定溶至50 mL，冰箱中可保存1个月。
1%过硫酸铵：0.5 g过硫酸铵加重蒸水定溶至50 mL，冰箱中可保存1周。
浓缩胶（3%）
分离胶贮液：2.0 mL
Tris-柠檬酸（pH6.8）：2.0 mL
2%Na2SO4：0.2 mL
蒸馏水：14.8 mL
1%过硫酸铵：0.6 mL
TEMED: 30 μL
配制方法：
浓缩胶贮液：同分离胶贮液。
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Tris-柠檬酸（pH6.8）：1.55 g Tris + 0.1 g 柠檬酸（C6H8O7·H2O）加重蒸水溶解，调pH至6.8，最终定溶至100 mL，滤纸过滤后置冰箱中保存。
⑵、染色方法：
1. 1%可溶性淀粉（一定要在沸水中煮沸到无色透明无沉淀为止），均匀地涂倒在胶板面上。静
置1小时。
2. 用0.15mol/L HAc缓冲液（pH 5.0）洗去胶板表面剩余的淀粉，然后加100 mL 0.15 mol/L
HAc缓冲液（pH 5.0），在37℃温箱保温1.5小时。
3. 加显色碘液10 mL，在兰色背景上出现白色透明、粉红、红或褐色条带，即为淀粉酶。
配制方法：
1%可溶性淀粉：0.1 g可溶性淀粉溶于10 mL pH8.9的Tris-柠檬酸缓冲液中，在水浴中煮沸，搅拌到完全透明无沉淀为止：——本试剂需随配随用。
0.15mol/L HAc缓冲液（pH 5.0）：称取11.9 g NaAc，加重蒸水溶解，用冰HAc调pH至5.0，最终加重蒸水至1000 mL。
显色碘液：称取KI 15.8 g，加到10 g 碘溶液中（先在95%乙醇中溶解），最终加重蒸水至1000 mL，用时稀释20倍。
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⑶、保存液：
固定液：冰醋酸 : 甲醇 : 水 = 40 : 100 : 320
⑷、电极缓冲液贮液：
采用低离子强度电极缓冲液，称取6.2 g Tris，加入2.0 g Gly，加重蒸水定容至1000 mL，用时稀释5倍，pH值8.7。
⑸、2%溴酚蓝溶液：
称取1.0 g溴酚蓝加蒸馏水至50 mL。
二、过氧化氢酶：
⑴、制胶方法：
分离胶（7%，20 mL）
分离胶贮液：4.5 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：7.5 mL
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重蒸水：7.5 mL
1%过硫酸铵：0.5 mL
TEMED：35 μL
配制方法： 分离胶贮液：同上
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）缓冲液：称取121.14 g Tris放入1000 mL烧杯中，加重蒸水800 mL溶解，用浓HCl调至pH8.8，倒入1000 mL容量瓶，定容至1000 mL，滤纸过滤，冰箱中可保存3个月。
浓缩胶（4%，10mL）
分离胶贮液：1.3 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：1.3 mL
重蒸水：6.4 mL
1%过硫酸铵：1.0 mL
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TEMED：10.0 μL
配制方法：
浓缩胶贮液：同分离胶贮液。
1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：称取12.114 g Tris放入100 mL烧杯中，加重蒸水溶解，用浓HCl调至pH6.8，倒入100 mL容量瓶，定容至100 mL，定性滤纸过滤，冰箱中可保存3个月。
⑵、染色方法：
1、 用蒸馏水将电泳胶板冲洗1～2次，然后用0.3% H2O2 溶液100 mL浸泡胶板1～5分钟，在浸泡过程中不断振荡染色盘使之浸泡均匀。
2、 浸泡结束，倒掉过氧化氢溶液，并用蒸馏水将胶板冲洗1～2次。再用4%可溶性淀粉溶液100 mL（染色前一天配置更好）浸泡胶板1小时。
3、 浸泡结束，倒掉淀粉溶液，用蒸馏水把胶板冲洗1～2次。再用50 mL 2%铁氰化钾和50 mL 2%三氯化铁混合物进行负染色10分钟，待胶板在草绿色背景上出现浅黄色酶带时停止染色，倒掉染色液，水洗胶板1～2次。
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
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4%可溶性淀粉溶液：4 g可溶性淀粉溶于100 mL pH8.8 Tris-HCl缓冲液中，在水浴中煮沸至透明无色为止。
2%铁氰化钾：铁氰化钾2 g溶解至100 mL。
2%三氯化铁：三氯化铁2 g（3.33 g FeCl3·6H2O）溶解至100 mL。
⑶、保存液： 可直接用重蒸水。
⑷、电极缓冲液：
称取141.2 g Gly，加30 g Tris，加重蒸水定容至1000 mL配成原液，用时稀释25倍，pH值8.3。
三、苹果酸脱氢酶
⑴、制胶方法：
分离胶（7%）
分离胶贮液：6.8 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：22.4 mL
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1%过硫酸铵:0.8 mL
TEMED：40 μL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。浓缩胶（3%）
分离胶贮液：4.0 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：4.0 mL
重蒸水：30.8 mL
1%过硫酸铵: 1.2 mL
TEMED：60 μL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。⑵、染色方法：
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染色液：NAD+：0.05g
NBT：0.03g
PMS：0.002g
1 mol/L L-苹果酸钠（pH7.0）：10 mL
0.5 Tris-HCl缓冲液（pH7.1）：20 mL
水：70 mL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温30～60分钟，显示深兰色区带。用无离子水漂洗，再用7.5%醋酸固定保存（或者用7.5%醋酸-30%乙醇-15%甘油）
四、乳酸脱氢酶
⑴、制胶方法：
分离胶（7.5%）
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分离胶缓冲液：3 mL
分离胶贮液： 6 mLl
0.14%过硫酸铵 12 mL
水：3 mL
TEMED :15 uL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。浓缩胶（2.5%）
浓缩胶缓冲液：1.5 mL
浓缩胶贮液：3 mL
核黄素：1.5 mL
蔗糖：6 mL
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TEMED：18 uL
配制方法：
0.3% H2O2：1 mL 30% H2O2，加重蒸水至100 mL。
⑵、染色方法：
染色液：NAD+: 0.05g
NBT: 0.03g
PMS: 0.002g
1 mol/L乳酸钠液（pH7.0）：10 mL
0.1 mol/L氯化钠：5 mL
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.1）：15 mL
水：70 mL
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温30～60分钟，即可显示蓝紫色区带。可用无离子水漂洗，再用7%醋酸固定，以终止酶促反应。
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五、醇脱氢酶
制胶方法：同乳酸脱氢酶
染色方法：NAD+：0.025g
NBT：0.015g
PMs：0.001g
95%乙醇：2 mL
0.2M Tris-HCl 缓冲液：7 mL
水：41 mL
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温直至显示深兰色区带，用无离子水漂洗，固定保存于7.5%醋酸。
六、酯酶
制胶方法：同乳酸脱氢酶
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染色方法：
染色液：1% α、β-醋酸萘酯：3 mL
坚牢蓝RR：0.1g
0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.1）:10 mL
加水配制成100 mL.
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，于37℃保温约40分钟，或室温下直至显示出棕色的区带。用无离子水漂洗。固定保存于7.5%醋酸-30%乙醇-15%甘油中。
七、过氧化物酶
制胶方法：同乳酸脱氢酶
染色方法：
染色液：2% 联苯胺：10 mL
抗坏血酸：35.2 mg
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0.6% H2O2: 10 mL
水：30 mL
注意：在配制联苯胺贮液时，加几滴酒精或微温热冰醋酸可起助溶作用。
显色：将电泳后凝胶板浸入染色液，室温下1-5分钟后显示兰色区带。用无离子水漂洗，固定保存于（乙醇：乙酸：甘油：水 = 5：2：1：4）的混合液中
八、苹果酸酶
制胶方法：
分离胶（10%）：
分离胶贮液：6.5 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：7.5 mL
蒸馏水：5.5 mL
1%过硫酸铵：0.5 mL
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TEMED：35 uL
浓缩胶（4%）：
分离胶贮液：1.3 mL
1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）：1.3 mL
蒸馏水：6.4 mL
1%过硫酸铵：1.0 mL
TEMED：10 uL
染色方法：
电泳结束用水漂洗胶板后，倒入50 mL染色液（内含NADP15 mg，NBT15 mg，PMS1 mg，MgCl2 50 mg，1mol/L L-苹果酸钠盐，(pH7.0) 5mL，0.2mol/L Tris-HCl (pH8.0) 10 mL,蒸馏水 35mL）中。在37℃黑暗条件下保温，直至显出深蓝色酶带。弃染色液用水漂洗胶板后放入乙醇：甘油：水=1：1：2 溶液中保存。
九、超氧化物歧化酶
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制胶方法：
分离胶（10%）
分离胶贮液：6.5 mL
1 mol/L Tris-HCl (pH8.8)：7.5mL
蒸馏水：5.5 mL
1%过硫酸铵：0.5 mL
TEMED：35 uL
浓缩胶（4%）
分离胶贮液：1.3 mL
1 mol/L Tris-HCl (pH6.8)：1.3 mL
蒸馏水：6.4 mL
1%过硫酸铵：1.0 mL
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TEMED：10 uL
染色方法：
电泳结束后，将凝胶置于染色液中，至酶带清晰为止。染色后，凝胶柱用水漂洗并保存。
步骤：
1、将凝胶浸泡在2.45×10-4mol/l的NBT溶液中20min。注意要遮光，在黑暗中，温度最好低一点，在冰箱里也可；NBT如变成无色或有沉淀，则需重新再配
2、然后转移到0.028 mol/L 四甲基乙二胺，2.8 ×10-5 mol/L核黄素和0.036 mol/L磷酸盐缓冲液(PH值7.8)中浸泡20 min。在80瓦光下进行，来回振荡
3、最后将胶放在0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.8），10-4 mol/L的EDTA溶液中光照20min并显带。也是在80瓦光照下进行，EDTA要溶解充分
注意：以上步骤，要严格控制好时间，NBT，磷酸盐缓冲液可以先配保存。
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