[12]发明专利申请公开说明书
[21]申请号97106570.5
[51]Int.CI6
C07K 14/585C12N 15/16C12N 15/09C12N 15/79
[43]公开日1998年3月11日[22]申请日97.8.19
[71]申请人复旦大学
地址200433上海市邯郸路220号
[72]发明人郑兆鑫 严维耀 孙立春 李光金 汤健
[11]公开号CN 1175586A
[74]专利代理机构复旦大学专利事务所
代理人姚静芳
C12P 21/00
权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页
[54]发明名称
带有降钙素基因相关肽(CGRP)的基因结构及其制备方法[57]摘要
本发明是关于CGRPDNA直接注射及该基因的设计、构建和DNA提取。CGRP具有降血压等作用,但易被降解,作用时间短,因而成本高、价格贵。本发明设计了一段信号肽,蛋白裂解位点,酰胺化位点及CGRP本身在内的多肽序列,分子量为5—12KDa,再译成一段DNA序列,用化学合成法合成多个片段,经互补配对、串联成完整的基因序列,最终插入到真核表面载体,提取DNA,并直接注射DNA到动物体内,产生长时间的、明显的降压作用。
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权 利 要 求 书
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1. 一种带有降钙素基因相关肽(CGRP)的基因结构，CGRP是由37个氨基酸组成的活性小肽，其特征在于：所设计的用于DNA直接注射的完整基因是在CGRP的N端有一个哺乳动物细胞启动子、一段信号肽及一个蛋白裂解位点，在CGRP的C端有一个酰胺化位点，其基因结构及CGRP氨基酸序列为：A：基因结构
B：CGRP氨基酸序列
人α-CGRP：Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser人β-CGRP：--- --- Asn --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe--- --- --- --- Met --- --- Ser --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 2.根据权利要求1所述的CGRP的基因结构，其特征在于CGRP前体蛋白分子量为5--12KDa，参与编码该功能片段的DNA大小为0.5-5kb。
3.根据权利要求1所述的CGRP的基因结构，其特征在于上述CGRP DNA插入到真核表达载体，可直接注射。
4.一种带有CGRP基因的DNA的制备方法，包括基因重组、DNA制备，其特征在于：
(1)用化学合成的方法合成数个基因片段，并将其串联成为完整基因，置于合适的载体中，构成权利要求1A所述结构；
(2)将上述基因克隆到克隆载体上，或者直接克隆到真核表达载体上，序列分析以确证完整基因序列；
(3)将完整基因从克隆载体上切下，再插入到真核表达载体中，重组质粒转化细菌，得到重组菌株；
(4)将菌株置于细菌培养液中培养，培养温度在28-42℃之间，培养时间为8-30小时，培养液中需加入20-100ug/ml的氨苄青霉素，然后收集菌体，抽提质粒DNA用于直接注射。
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说 明 书
带有降钙素基因相关肽(CGRP)的基因结构及其制备方法
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本发明属遗传工程领域。
CGRP广泛分布于中枢神经系统，周围神经系统，心血管系统，泌尿系统等组织器官中。并表现出多方面的生理功能。是强有力的血管舒张剂，能降低血压、减慢心率、增加心肌收缩能力、提高血液输出量，在治疗严重的Raynaud综合征，阳痿，局部缺血的神经损伤及严重的心衰等方面也是一种有效的治疗剂，具有广泛的应用前景。尤其是现今世界上高血压，冠心病等心血管疾病病人日益增多，CGRP在这方面的功能使之具备了巨大的应用价值。但是CGRP本身为小肽蛋白，易被降解，作用时间短，生产成本高、价格贵，这些弱点使CGRP的应用受到一定的限制。 本发明的目的是设计一种基因结构并寻求其制备方法，使其能更有效、更持久的治疗心血管疾病，尤其达到长时间降低高血压至正常水平的目的。 本发明是一种带有降钙素基因相关肽(CGRP)并能用于直接注射的载体-CGRPDNA。表达的初产物为CGRP前体蛋白。CGRP本身是一37个氨基酸的多肽，人的α、β两种CGRP在肽链的第3位，22位，25位有微小差异，α-CGRP中第3位，22位，25位分别是Asp，Val，Asn；β-CGRP中第3位，22位，25位则分别是Asn，Met，Ser，而其余序列均相同。CGRP的N端有一信号肽，在信号肽与CGRP两者间有蛋白裂解位点，而在CGRP的C端有一酰胺化位点。完整基因的核苷酸序列则完全由所设计基因的氨基酸序列来确定。同时为便于连接到不同表达载体上，在核苷酸序列的5’端与3’端增加部分碱基或增加接头来增加不同酶切点以达到目的。而如果将该基因克隆到某些大肠杆菌-哺乳动物细胞穿梭表达载体上，可利用各自现成的酶切点达到目的。基因结构的核苷酸具体序列可以根据氨基酸序列来确定，如下就是其中一种：
GATGGGCTTCCAAAAGTTCTCCCCCTTCCTGGCTCTCAGCATCTTGGTCCTGTTGCAGGCAGGCAGCAAGAGAGCCTGTGACACTGCCACCTGTGTGACTCATCGGCTGGCAGGCTTGCTGAGCAGATCAGGGGGTGTGAAGAACAACTTTGTGCCCACCAATGTGGGTTCCAAAGCCTTTGGCAGGCGCCGCTGTATAAGC 启动子可根据不同载体或不同要求而定。
根据不同载体及其它不同要求，得到的CGRP前体蛋白分子量为5-3
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12KDa，CGRP本身的分子量约为4KDa，参与编码该功能片段的DNA大小为0.5-5kb。
本发明的CGRP基因与有关功能片段组合克隆到真核表达载体上，可直接注射到动物体内。
本发明的制备过程包括按照双链合成多片段并配对串联，重组质粒的构建，DNA提取，DNA注射。
按照所设计的CGRP氨基酸序列，再译成相应的核苷酸序列，并在其5‘端与3’端分别设计XhoI、NotI或其它切点。核苷酸序列全长约200bp，为双链粘性末端，分成数个短片段，其通常均由化学合成方法合成，再将它们互补配对，串联成完整基因，并插入到克隆载体pBluescriptIIKS+等上，可以根据克隆载体与真核表达载体的情况来确定合成基因两端的酶切位点，转化的大肠杆菌感受态细胞可以是C600，TG1，MC1061，JM101系列等。具体情况可见实施例。进行双酶切、PCR扩增及序列分析，确证转化子的序列与所设计的序列一致。转化子在一般性培养基如LB培养基上即可培养，培养基中加入20--100ug/ml的氨苄青霉素，于28--42℃的温度下培养8--24小时)，然后抽提质粒，将相关序列从克隆载体上切下，插入到真核表达载体中，也可直接克隆到真核表达载体上，再转化大肠杆菌感受态细胞，受体菌可以是C600，MC1061，TG1，JM101系列等。在含有20--100ug/ml的氨苄青霉素的平板上培养，用酶切、PCR方法鉴定转化子，确证该基因结构已克隆到真核载体上。然后大量培养转化子，在一般性培养基上培养即可，培养基中加入20--100ug/ml的氨苄青霉素，培养温度28--42℃，培养时间8--30小时，若质粒是严紧型，则可在培养数小时后加入终浓度为170ug/ml的氯霉素来扩增质粒，收集菌体，大量抽提质粒DNA，可用CsCl超离心或酚处理的方法，也可按需要进一步纯化DNA，所得的DNA即可直接用于注射。
菌体培养只要在含有20--100ug/ml的氨苄青霉素的LB培养基中即可，若用氯霉素扩增质粒，则可在培养基中加入蛋白胨，酵母膏等营养丰富的物质。 本发明由于所设计的基因结构含有信号肽，蛋白裂解位点及酰胺化位点，因而有利于CGRP的释放及表达其生理功能，按本发明方法制备的DNA本身可以直接注射动物，如自发性高血压大鼠，且具有有效的降压作用。图1列出了用所获得的pBPV-CGRP DNA直接注射自发性高血压大鼠(简称SHR)所产生的降压作用，在注射样品后的第一天，开始测定鼠血压变化情况，发现在第二天鼠血压开始下降，到第38天，仍有明显的降压作用，在第2天到第28天之间，降压作用更明显，血压降低一般超过了10％，最高超过了20％。图2则列出了用所获得的pCDM8-CGRPDNA直接注射SHR所产生的降压作用，在注射样品后的第一天，就发现SHR血压下降达6％以上，下降幅度在第二天则超过了10％，此后的近一个月内，下降幅度一直维持在10％以上，最高接近了20％，虽然SHR血压在此后10天内(第29-38天)有所回升，下降幅度仍接近10％。两种DNA均有明显的、长时间的降压作
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用。而对照组的血压相对稳定。虽然CGRP蛋白本身也具有明显的降压作用，但由于CGRP蛋白是一个仅由37个氨基酸组成的小肽，在体内易被降解，作用时间很短，而DNA本身又具有易提取、易纯化、耐高温、易保存等优点，因此使用CGRPDNA来注射比使用CGRP蛋白本身更具有潜在的应用价值。 图1pBPV-CGRP DNAd1降压作用。 图2pCDM8-CGRP DNA的降压作用。 实施例
按权利要求1，用化学合成法合成CGRP的完整双链基因(200bp)，分14个片段合成，将所有片段配对串联成完整基因，再将其插入到克隆载体pBluescript2KS+。
先取1.0微克pBluescriptIIKS+DNA用XhoI和NotI进行双酶切，于37℃反应一小时，再电泳，用玻璃奶回收DNA，同时加入10ul的串联基因(其中DNA含量为0.2ug)，两者混和后加入1单位的T4连接酶，3单位的ATP，在12--16℃下保温过夜，再将连接所得的重组DNA加入到200ul大肠杆菌感受态细胞中，4℃冰浴30分钟，42℃水浴90秒，4℃冰浴数分钟，加入1mlLB培养基，在37℃复苏45分钟，离心浓缩菌体至200ul，再倒入平板于37℃倒置过夜，挑取白色转化子，用XhoI/NotI双酶切、PCR扩增、DNA序列分析来确定转化子中基因序列与所设计的完全相符，并命名为pBL--CGRP。
将所得到的转化子pBL--CGRP DNA及真核表达载体pBPV和pCDM8同时用XhoI/NotI双酶切，用玻璃奶回收有关的DNA片段，并按上述方法将CGRP基因片段分别与pBPV、pCDM8混和连接，再转化大肠杆菌感受态细胞，转化子经XhoI/NotI双酶切鉴定及PCR扩增，来确证CGRP基因已插入到真核表达载体pBPV，pCDM8上，并分别命名为pBPV--CGRP，pCDMg--CGRP。在培养基如LB培养基上即可培养。培养基中加入适当的氨苄青霉素，对于pBPV-CGRP，加100微克/毫升，而对于pCDM8-CGRP，则加25微克/毫升，于37℃的温度下培养过夜，然后提取这两种质粒DNA，并直接注射到动物体内进行动物实验。pBPV-CGRP、pCDM8-CGRP的实验室编号分别为A960046、B960046。
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说 明 书 附 图
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