一种NK细胞培养液及多级激活NK细胞的培养方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112300992 A(43)申请公布日 2021.02.02

(21)申请号 202011162802.4(22)申请日 2020.10.27

(71)申请人 杜德（江门）生物科技有限公司

地址 529000 广东省江门市江海区南山路

333号产业加速园21幢(2#综合配套用房)首层和二层自编202室(信息申报制)(72)发明人 张玲洁　陈爱华　

(74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限

公司 11227

代理人 苏云辉(51)Int.Cl.

C12N 5/0783(2010.01)

权利要求书2页 说明书7页 附图2页

(54)发明名称

一种NK细胞培养液及多级激活NK细胞的培养方法(57)摘要

本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及一种NK细胞培养液及多级激活NK细胞的培养方法。本发明公开了一种NK细胞培养液，该细胞培养液在NK细胞培养过程中，依次采用培养液A、培养液B和培养液C经三级激活NK细胞，各组分相互配合共同促进NK细胞大量增殖，并提高NK细胞的得率。由实验数据可知，本发明提供的NK细胞培养液培养获得的NK细胞的细胞活率可达到99.11％，细胞总数由诱导前的4×107个单个核培养得到80.75×108个，NK细胞含量达到96％以上，对四种癌细胞的杀伤率高，效果显著优于对照组采用二级激活或采用其它浓度的包被液。

CN 112300992 ACN 112300992 A

权　利　要　求　书

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1.一种NK细胞培养液，其特征在于，包括：包被液、培养液A、培养液B和培养液C；所述包被液包括：抗人CD3抗体和抗人CD56抗体；所述培养液A包括：人血清白蛋白和基础培养基；所述培养液B包括：抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白和基础培养基；所述培养液C包括：IL-2、人血清白蛋白和基础培养基。2.根据权利要求1所述的NK细胞培养液，其特征在于，所述包被液中，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为100-500ng/ml、100-500ng/ml；

所述培养液A中，所述人血清白蛋白的终浓度为40-50g/L；所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白的终浓度依次为20-50ug/ml、200-500U/ml、50-100ng/ml、40-50g/L。

所述培养液C中，所述IL-2和人血清白蛋白的终浓度分别为200-500U/ml、40-50g/L。3.根据权利要求2所述的NK细胞培养液，其特征在于，所述包被液中，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为300ng/ml、300ng/ml；

所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2和IL-15的终浓度分别30ug/ml、300U/ml、75ng/ml；

所述培养液C中，所述IL-2的终浓度为300U/ml。4.根据权利要求1所述的NK细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基为无血清培养基。

5.一种NK细胞培养试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任意一项所述的NK细胞培养液。

6.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：第0天，将外周血单个细胞接种于培养液A中，并移入经包被液包被的培养瓶中进行培养；

步骤2：培养至第3天，加入培养液B继续培养；步骤3：培养至第5、7、8、9、11、12天分别加入培养液C继续培养，培养至14天，收获NK细胞；

所述包被液包括：抗人CD3抗体和抗人CD56抗体；所述培养液A包括：人血清白蛋白和基础培养基；所述培养液B包括：抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白和基础培养基；所述培养液C包括：IL-2、人血清白蛋白和基础培养基。7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述包被液中，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为100-500ng/ml、100-500ng/ml；

所述培养液A中，所述人血清白蛋白的终浓度为40-50g/L；所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白的终浓度依次为20-50ug/ml、200-500U/ml、50-100ng/ml、40-50g/L。

所述培养液C中，所述IL-2和人血清白蛋白的终浓度分别为200-500U/ml、40-50g/L。8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述包被液中，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为300ng/ml、300ng/ml；

所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2和IL-15的终浓度分别30ug/ml、

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300U/ml、75ng/ml；

所述培养液C中，所述IL-2的终浓度为300U/ml。9.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞的接种密度为2×106个/ml。

10.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，在细胞培养过程中，维持细胞密度为4×106个/ml。

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一种NK细胞培养液及多级激活NK细胞的培养方法

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技术领域

[0001]本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及一种NK细胞培养液及多级激活NK细胞的培养方法。

背景技术

[0002]外周血(peripheral blood)是遍布在机体全身的血液，通常可捐献再生。近十几年的研究发现，外周血中含有可以重建人体造血和免疫系统的各种细胞，可用于提高免疫力，治疗80多种疾病。因此，外周血已成为免疫细胞的重要来源，特别是无血缘关系的免疫细胞的来源，已经成为一种非常重要的人类生物资源。[0003]自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是人类血液系统中重要的免疫细胞，在外周血中的含量也很丰富。众所周知，机体防御体系的第一道防线就是NK细胞，其在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，而且在天然免疫系统其发挥主要杀瘤效应，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。[0004]随着临床需求的NK细胞越来越多，涌现出了很多针对NK细胞培养扩增的方法、培养基等等。目前有很多利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞的方法，但扩增的NK细胞细胞数量达不到临床需求，而且纯度低，对癌细胞的杀伤效果差。因此，提供一种能大量扩增、纯度高、杀伤性效果好的NK细胞的方法，是NK细胞体外扩增领域亟待解决的问题之一。发明内容

[0005]本发明提供了一种NK细胞培养液及多级激活NK细胞的培养方法，解决了现有的NK细胞培养液扩增得到NK细胞数量达不到临床需求，而且纯度低，对癌细胞的杀伤效果差的问题。

[0006]其具体技术方案如下：

[0007]本发明提供了一种NK细胞培养液，包括：包被液、培养液A、培养液B和培养液C；[0008]所述包被液包括：抗人CD3抗体和抗人CD56抗体；[0009]所述培养液A包括：人血清白蛋白和基础培养基；[0010]所述培养液B包括：抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白和基础培养基；

[0011]所述培养液C包括：IL-2、人血清白蛋白和基础培养基。[0012]本发明中，基础培养基为NK细胞无血清培养基，抗人CD3抗体为人源化抗人CD3单克隆抗体，抗人CD56抗体为人源化抗人CD56单克隆抗体，IL-2为重组人IL-2，IL-15为重组人IL-15。

[0013]优选地，所述包被液中，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为100-500ng/ml、100-500ng/ml；[0014]所述培养液A中，所述人血清白蛋白的终浓度为40-50g/L，优选为40g/L；[0015]所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白的终浓度

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依次为20-50ug/ml，优选为30ug/ml、200-500U/ml，优选为300U/ml、50-100ng/ml，优选为75ng/ml、40-50g/L，优选为40g/L。[0016]所述培养液C中，所述IL-2和人血清白蛋白的终浓度分别为200-500U/ml，优选为300U/ml、40-50g/L，优选为40g/L。[0017]更优选地，所述包被液中，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为300ng/ml、300ng/ml；[0018]所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2和IL-15的终浓度分别30ug/ml、300U/ml、75ng/ml；

[0019]所述培养液C中，所述IL-2的终浓度为300U/ml。[0020]本发明还提供了一种NK细胞培养试剂盒，包括上述NK细胞培养液。[0021]本发明还提供了一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤：[0022]步骤1：第0天，将外周血单个核细胞接种于培养液A中，并移入经包被液包被的培养瓶中进行培养；[0023]步骤2：培养至第3天，加入培养液B继续培养；[0024]步骤3：培养至第5、7、8、9、11、12天分别加入培养液C继续培养，培养至14天，收获NK细胞；

[0025]所述包被液包括：抗人CD3抗体和抗人CD56抗体；[0026]所述培养液A包括：人血清白蛋白和基础培养基；[0027]所述培养液B包括：抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白和基础培养基；

[0028]所述培养液C包括：IL-2、人血清白蛋白和基础培养基。[0029]本发明将外周血单个核细胞接种于培养液A中，培养液A用于促进外周血单个核细胞向NK细胞转化，培养至第3天，加入培养液B，培养液B中抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15和人血清白蛋白共同刺激NK细胞大量增殖，培养至第5天加入培养液C，并间隔补充培养液C至第9天，然后连续三天连续补充培养液C，保证NK细胞充分激活。[0030]本发明NK细胞的培养方法中，所述包被液中，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为100-500ng/ml、100-500ng/ml；[0031]所述培养液A中，所述人血清白蛋白的终浓度为40-50g/L；[0032]所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白的终浓度依次为20-50ug/ml、200-500U/ml、50-100ng/ml、40-50g/L。[0033]所述培养液C中，所述IL-2和人血清白蛋白的终浓度分别为200-500U/ml、40-50g/L。

[0034]优选地，所述抗人CD3抗体和抗人CD56抗体的终浓度分别为300ng/ml、300ng/ml；[0035]所述培养液B中，所述抗人HER-2单克隆抗体、IL-2和IL-15的终浓度分别30ug/ml、300U/ml、75ng/ml；

[0036]所述培养液C中，所述IL-2的终浓度为300U/ml。[0037]优选地，所述外周血单个核细胞的接种密度为2×106个/ml。[0038]优选地，在细胞培养过程中，维持细胞密度为4×106个/ml。[0039]从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

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本发明提供了一种NK细胞培养液，包括：包被液、培养液A、培养液B和培养液C；包

被液包括：抗人CD3抗体和抗人CD56抗体；培养液A包括：人血清白蛋白和基础培养基；培养液B包括：抗人HER-2单克隆抗体、IL-2、IL-15、人血清白蛋白和基础培养基；培养液C包括：IL-2、人血清白蛋白和基础培养基。该细胞培养液在NK细胞培养过程中，依次采用培养液A、培养液B和培养液C经三级激活NK细胞，各组分相互配合共同促进NK细胞大量增殖，并提高NK细胞的得率。由实验数据可知，本发明提供的NK细胞培养液培养获得的NK细胞的细胞活率可达到99.11％，细胞总数由诱导前的4×107个单个核培养得到80.75×108个细胞，NK细胞含量达到96％以上，对四种癌细胞的杀伤率高，效果显著优于对照组采用二级激活或采用其它浓度的包被液。

附图说明

[0041]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

[0042]图1为本发明实施例1中外周血NK细胞的流式检测结果图；

[0043]图2为本发明实施例1中收获的实验组NK细胞的流式检测结果图；

[0044]图3为本发明实施例1～3收获的NK细胞对四种癌细胞的杀伤能力检测结果图。具体实施方式

[0045]为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。[0046]本发明实施例中所使用的试剂均为市购。抗人CD3抗体和抗人CD56抗体以及IL-2、IL-15均购自广州东锐科技有限公司，HER-2单克隆抗体购自北京同立海源生物科技有限公司，人血白蛋白购自瑞士杰特贝林生物制品有限公司，基础培养基购自TAKABA，K562、HEP G2、A549、HELA均从中科院上海细胞库获得。[0047]实施例1[0048]一、外周血采集与分离单个核细胞[0049]1、筛选25岁、男性、身体健康无疾病、体检正常，血常规和病毒四项检查(乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病)无异常作为实验样本，并抽取其静脉中的血液，收集于含10ml 20IU/ml的肝素钠采集袋中；[0050]2、将血液样品带回实验室后，立即在安全柜中进行操作，取出1ml血样进行NK流式检测(如图1和表2所示)，然后开始分离剩余血样中的单个核细胞；[0051]3、将血液加入含有Ficoll分离液的离心管，800g离心20min，吸取白膜层的细胞，离心洗涤2次，沉淀物即为外周血单个核细胞，并计数。[0052]二、外周血NK细胞的培养[0053]1、取步骤一获得的外周血单个核细胞，分为五组(实验组、对照组1、对照组2、对照

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组3、对照组4，每组4×107个的单个核细胞)。[0054]2、采用人源化抗人CD3、CD56抗体的T75悬浮细胞培养瓶中(人源化抗人CD3、CD56抗体在实验组和对照组1中的终浓度均为300ng/ml，在对照组3中的终浓度均为50ng/ml，在对照组4中的终浓度为600ng/ml)，包被90分钟或放入4度过夜。[0055]3、培养第0天，实验组和对照组1、3、4各用20ml无血清培养基、40g/L人血清白蛋白混匀，对照组2中用20ml的30ug/ml抗人HER-2单克隆抗体、300U/ml重组人IL-2、75ng/ml重组人IL-15、无血清培养基、40g/L人血清白蛋白混匀，备用。[0056]4、将步骤3制得的细胞悬液加入步骤2包被好的细胞培养瓶中，37度，5％二氧化碳，进行培养，补液时间和体积如表1所示，其中，培养液A：无血清培养基、40g/L人血清白蛋白；培养液B：30ug/ml抗人HER-2单克隆抗体、300U/ml重组人IL-2、75ng/ml重组人IL-15、无血清培养基、40g/L人血清白蛋白；培养液C：300U/ml重组人IL-2、无血清培养基、40g/L人血清白蛋白。[0057]5、培养至14天，离心收获细胞，采用BD流式仪检测NK细胞的纯度，结果如图2和表2所示。

[0058]使用台昐蓝染色法计算细胞的活率和总数，结果如表3所示。[0059]实施例2～实施例3

[0060]外周血采集与分离单个核细胞和外周血NK细胞的培养同实施例1。[0061]从图2和表2可以看出，经本实施例多级培养获得的NK细胞不仅数量高于对照组，而且纯度显著高于其它对照组NK细胞的纯度。[0062]从表3可以看出，实验组的细胞总数、细胞活率及NK细胞含量较高，与对照组1～4相比存在着显著性的差异(P<0.01)，说明相比于对照组1～2单级刺激NK细胞培养液，实验组多级刺激NK细胞培养液可以有效提高NK细胞的扩增数量和含量；相比于对照组3～4使用的50ng/ml、600ng/ml的包被液，实验组使用的300ng/ml的包被液可以进一步提高NK细胞的扩增数量和含量。[0063]表1 实施例1各NK培养时间和补液量

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表2 NK细胞流式检测结果

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表3 NK细胞的活率、总数及含量

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实施例3：NK杀伤癌细胞

[0072]在即将收获NK细胞时，准备一定数量的处于对数生长期的四种癌细胞：K562、HEP G2、A549、HELA，均来源于中科院上海细胞库；

[0073]采用测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性进而测定细胞损害的方法，运用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，设置杀伤比5:1，10:1，20:1，孵育4小时；[0074]使用酶标仪(带有490nm滤光片)测定吸光值；[0075]细胞损伤率(％)＝[(A-B-E)/(C-D-E)]×100[0076]A：E+T孔的吸光度-背景Blank的吸光度[0077]B：E低对照孔的吸光度-背景Blank的吸光度[0078]C：T高对照孔的吸光度-背景Blank的吸光度[0079]D：T高对照Blank的吸光度-背景Blank的吸光度[0080]E：T低对照的吸光度-背景Blank的吸光度[0081]计算得出NK细胞针对四种癌细胞的杀伤率。[0082]NK细胞杀伤活性检测结果如表4和图3所示，实验组培养得到的NK细胞对四种癌细胞的杀伤率较高，与对照组1～4相比存在着显著性的差异(P<0.01)，说明相比于对照组1～2单级刺激NK细胞培养液，实验组多级刺激NK细胞培养液可以有效提高NK细胞对癌细胞的杀伤力；相比于对照组3～4使用的50ng/ml、600ng/ml的包被液，实验组使用的300ng/ml的

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包被液可以进一步提高NK细胞的对癌细胞的杀伤力。[0083]表4 NK细胞对癌细胞的杀伤率

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[0086]

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

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说　明　书　附　图

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图3

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