摘要：迄今为止，全血中微血栓形成的实验室化验体系还未建立。微通道法可以通过血液流动速率来评价在全血中微血栓的形成。在本研究中，我们以微通道分析仪（MC-FAN）作为实验室化验体系，描述了血液凝结物活化和毛细血管堵塞的关系。经脂多糖（LPS）处理过的全血流速对剂量和时间有依赖性并成下降关系。如果向全血中添加经LPS预处理过的单核细胞（PBMC），血流速度将减慢。如果经抗组织因子（TF）预处理，抗体将阻碍由脂多糖诱导而造成的血液流速下降，这暗示着表现在PBMC上的TF是造成微通道内血液流动速度减慢的原因。一直的抗凝剂和抗血小板剂都会抑制由LPS造成全血流速变慢。血栓-抗血栓联合体在LPS-模拟全血中增加。如果在其中添加抗凝剂，血栓-抗血栓联合体减少，但对抗血小板因子没有相关变化。这些发现表明在微通道内的堵塞主要是因为由纤维蛋白网和血小板凝聚组成的微血栓。而这些微血栓是由于TF在活性PBMC上的表现而形成的。另外，我们同样发现MC-FAN对于毛细血管中的抗微血栓的实验室评价是非常有效的。
简介：炎症是免疫系统对于由诸如细菌和病毒引起的微生物病原体感染而造成的细胞和组织损伤的反应[1]。凝结的通道可以通过这些微生物病原体进行活化，诱导在单核细胞上的组织因子的表达[2]。TF可以活化一系列的蛋白水解级联[3]，这致使凝血剂装转换为血栓。而血栓又由纤维蛋白原中生成纤维蛋白。凝结的活化会促使凝结生成并降低纤维蛋白的消解，这就导致在微血管中纤维蛋白凝结物的沉积，进而可能造成组织血液不充分灌注并造成多组织缺障（MOF）[4]。
剧烈炎症会首先诱导位于单核细胞上的TF表达，激活血液凝结。TF在主体对病菌感染的响应上起了很大的作用[5]。我们知道，微生物诱导细胞活性性是凝结系统的TF媒介活性化的结果[6，7]。因此控制炎症响应将首要关联到增强血液的凝集性上[8-10]，而该病症的多种关联病理反应是形成异常血管内凝结和最终会导致器官缺障的血栓的首要原因[11，14]。因此测量微血栓的形成可以为器官紊乱程度提供信息，并为我们找出治疗的方法。但是，目前还不清楚，微血管内如何产生堵塞和血栓如何导致MOF。另外，一般的血浆凝结测试可以包括活化部分凝血酶时间测定（APTT）、血浆凝血酶原时间测定（PT）、血小板凝集测定，这些测试可以不能得到器官内的微循环状况和其后的外源性脂多糖（LPS）或TF诱导血凝结活性。
在本研究中，我们开发了一种新的临床化验系统，这就是通过微通道分析仪（MC-FAN）来评价单核细胞活性对微血栓形成的影响。我们同样还利用MC-FAN检测了多种抗血栓剂在毛细血管堵塞上的效果，并且发现该系统对于评价抗血栓和抗血小板剂在血栓紊乱上的效果是非常有效的。
试验过程 材料
LPS（血清型 O26：B6）和RPMI1640培养基来自Sigma（St. Louis,MO,USA）。单聚分解培养基来自于Dainippon Pharmaceutical（Suita，Osaka，Japan）。胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL，生命技术（Rockyville，MD，USA）。单克隆TF抗体由Chugai制药提供（Gotenba，Shizuoka，Japan）。Heparin购自Wako(Chuo-ku,Osaka,Japan)。Hirudin来自日本能源有限公司（Toda，Saitama，Japan）。Vlla因子，活性蛋白C（APC）和TF途径抑制物（TFPI）由Chemo-Sera协会提供（Okubo，Kumamoto，Japan）。TNFа和细胞重组可溶TM（sTM）由Asahi Chem（Fuji，Shizuoka，Japan）提供。抗血小板GPⅡb/Ⅲa拮抗剂（FK633）来自Fujisawa
药业（Chuo-ku，Osaka，Japan）。针对抗血栓化合物（TAT）和凝血素片段1+2（F1+2）的酶标记免疫附测定法（ELISA）套件 来自Cedarlane（Hornby，Ontario，Canada）。
使用MC-FAN测量血液流速的方法
图1A示意说明了Kikuchi利用MC-FAN的微通道法[12]原理。MC-FAN通过测定流过硅晶片上的微小液体通道的血流来分析微血栓的形成。而这些微小液体通道是通过半导体精细加工技术加工出来的（日立高科电子，东京，日本）。图1B说明了晶片固定器的设置，其中包括一块刻蚀着8736条7μm宽（和微通道尺寸相近）、30μm长的沟槽。刻蚀在单晶硅芯片上的沟槽不会活化血细胞和血浆蛋白，在其上盖上光学平板玻璃就变成了密封的微通道。在硅晶片固定器的入口连接着100μl的样品吸量管。这样，当连接到固定器出口处的带有20cm水的负压电磁阀开通时，样品就会流过微通道。所有实验使用经柠檬酸钠处理过的全血。全血收集自健康志愿者的肘前横脉并以3.8%的柠檬酸钠作为抗凝剂处理。此后，500μl的全血样品将转移到吸量管中。系统测定吸量管中样品通过硅晶片流路的时间，共测定100μl样品，以每10μl样品显示。同时全血流过硅晶片的过程会经过摄像机监控并记录在PC硬盘上。在每次测试血样前，系统都回测量100μl磷酸盐缓冲溶液在常压下的通过时间，并将其校正为12s。流速通过每小时通过硅晶片的平均血样体积来测定。全血流速通过以下公式计算：
血液流速（μl/s）=（10μl/Tn）的平均值 Tn：每10μl全血的通过实际，n=1到10。
扫描电镜
硅晶片用在0.1M磷酸盐缓冲溶液的2.5%戊二醛进行清洗，pH值为7.4。硅晶片用磷酸盐缓冲溶液清洗，再用在0.1M磷酸盐缓冲溶液中的1%OsO4进行再冲洗。这样残余的细胞脱水并经临界点干燥，之后安上扫描电镜短轴并用PtPd包裹。在JOEL JSM-T200扫描电镜（东京，日本）在15kv加速电压下成像之前，请将短棒保存在干燥的地方。
LPS-刺激全血的流速测定
用10μl不同浓度（0.16-20μg/ml）的LPS在37℃下分别培养1毫升的全血数个小时。将10μl的PBS添加到参比样品中，调解血球容积。此后立即将40μl的250mMCaCl2添加到经LPS处理的全血中，并用MC-FAN测定血液流速。
LPS-刺激PBMC在血液流速上的影响测定
根据生产商的说明，人体的PBMC可以通过单体聚合分解媒介（Mono-Poly resolving medium）进行分离。简单讲，将经柠檬酸盐处理的全血覆盖到单体聚合分解媒介上，并在1500rpm下离心分离20分钟。此后用PBS吸取PBMC馏分，并在含10%PBS的RPMI1640媒介中悬浮。在RPMI1640种PBMC受不同浓度的LPS或TNFа刺激3个小时。在培养以后，用细胞刮收集PBMC并进行分离。将细胞球（5.0×105个）添加到1ml柠檬酸处理过的全血中并进行重组，在添加氯化钙后就可以用MC-FAN测定全血流速了。
抗组织因子抗体，抗凝结，或抗血小板剂对LPS-刺激全血的影响
为了测定抗组织因子（TF）抗体，抗凝结剂（heparin，hirudin，APC，sTM和TFPI）以及抗血小板剂（FK633为GPⅡb/Ⅲa拮抗剂，西洛他唑（cilostazol），扩冠嗪（dilazep），和盐酸沙格雷酯（Sarpogrelate））对LPS（4μg/ml）-刺激全血的作用，样品先用PBS（参比）或对应的抗血栓剂处理15分钟，此后利用MC-FAN测定血液流速。为了分析抗组织因子抗体，抗凝剂，或抗血小板剂对于LPS-刺激全血流变性效果，将1μl不同浓度的这些制剂添加到1ml经LPS处理3小时的全血中，并在37℃下培养15分钟。在实验中，最终添加剂的浓度如下：抗TF抗体（1-200mg/ml），heparin和hirudin（0.01-1U/ml），和APC，sTM，FK633，西洛他唑（cilostazol），扩冠嗪（dilazep），和盐酸沙格雷酯（Sarpogrelate）（0.01-1μg/ml）。
图2 血液流经MC-FAN的图像。在添加了氯化钙的柠檬酸化全血中血液流经微通道40秒。
TAT和F1+2的免疫测定
为了测定在全血样品中的TAT和F1+2，将500μl的全血样品等分放到单独的塑料试管中。将10μl的LPS（200μg/ml）添加到血样中进行培养。经刺激后，向每个样品中添加5μl的抗凝剂和抗血小板剂并在37℃下培养5分钟。在实验中添加的添加剂的浓度如上所述。在经过培养之后，向每个试管中添加20μlCaCl2（250mM）并按照指定时间培养，此后向样品中添加20μlEDTA终止反应。为了去除细胞组分和凝结物，将血样以8000rpm离心5min。收集剩余血清，为了免疫在-20℃下进行保存。血清样本中TAT和F1+2的ELISA根据制造商手册进行操作。 数据
TM
相关系数，变异系数和自身对照t检验（paired student's t-test）用Stat View（SAS Institute，Cary，NC）的为Maxintosh开发的软件包行计算。 结果
LPS-激活全血的流速
我们利用MC-FAN来测定在LPS-激活全血中的微血栓的形成。图.2显示在经LPS处理之前（A）和之后（B）的血样由硅晶片的上游流到下游的图片。扫描电镜图片（图.2C）显示，在微通道中沉积的微血栓是由包含红细胞、白细胞和团聚的血小板组成的纤维网组成的。通过硅晶片的全血体积和时间间隔的定量关系如图.3A显示未经LPS处理的全血每通过时间的通过体积几乎为恒量，而经过LPS处理的血液具有时间依赖性，并随时间增加而减少。图.3B显示的是根据在实验步骤中陈述过的处理过程，用LPS和未用LPS处理的血液流速。如图.4A所示，经柠檬酸在37℃下培养3h后，未经LPS处理的全血流速没有显著的变化。但是经过六个小时培养后流速下降。LPS会致使血液流速随时间和浓度的增加而下降。为了测定在微血栓形成过程中的活性单核细胞的作用，我们用LPS或TNAа处理PBMC，并将它添加到全血样品中。其中添加了PBMC的全血对LPS浓度有依赖性，并成反相关。高浓度的TNFа（超过
100U/ml）同样造成血液流速下降（未显示数据）。
抗TF抗体和抗凝剂在LPS处理全血流速上的效果
添加抗TF抗体可以显著的削弱LPS刺激全血流动速度的下降程度（Fig.5A）。当我们用浓度大于100ng/ml的抗TF抗体处理血液后，血流速度恢复到未经LPS刺激的状况。添加强性抗凝剂同样也可以防止LPS刺激全血的流速下降（图.5B-F）。浓度高于0.1U/ml的Heparin可以显著改善血液流速的下降程度。同样的，添加浓度在0.1U/ml以上的Hirudin也可以改善LPS刺激全血的流速的下降程度。像血样中添加天然抗凝剂APC（浓度在0.1μg/ml以上）同样可以恢复血液流速。重组sTM是凝血蛋白C活化的抗凝血余因子。它可以在浓度低于APC使用浓度的情况下，显著地阻止血液流速的降低。另外，TFPI是一种Kunitz型蛋白抑制剂的VⅡa和Xa因子，在有TF的情况下，可以近似减小由于LPS造成的血液流速下降。
抗血小板剂对LPS刺激全血的流速的影响
为了评价血小板抑制剂是否强于由于血栓引起的血栓形成，我们使用MC-FAN来测试抗血小板剂在LPS刺激全血上的作用。添加抗血小板剂（FK633，西洛他唑（cilostazol），扩冠嗪（dilazep），和盐酸沙格雷酯（Sarpogrelate））对由于LPS造成的血液流速减慢的抑制能力和浓度相关。
抗凝剂和抗血小板剂对在LPS刺激全血中的TAT和F1+2产物的影响
为了研究在微通道中的血液凝结活化和微血栓形成，我们在血液流速由于LPS刺激而下降的情况下测定了TAT和凝血素导出片断F1+2的产物。在未刺激全血中，我们并没有检测到TAT，但是在LPS刺激全血中，我们却检测到了相关成分，并且其含量和LPS剂量成正比（图.7）。TAT形成的最强抑制剂为抗TF抗体。向LPS刺激全血中添加其他抗凝剂可以部分抑制TAT的生成，并且效果和剂量成正比。F1+2在未刺激全血中同样没有发现，但是在用LPS刺激的全血中却成增加的趋势（数据未显示）。F1+2水平的上升同样会因为抗凝剂的存在而被抑制。所有的抗血小板剂都以相似的方式改进血液流速，只有盐酸沙格雷酯（Sarpogrelate）趋向于抑制TAT的产生，虽然何剂量的相关性很弱（数据未显示）。 讨论
生成微血栓可能导致周围动脉堵塞，进而造成器官萎缩，细胞坏死，并且最终导致MOF[4]。堵塞流速的紊乱可能是由于血管内活化血和/或内皮细胞[13,14]在远离微血栓形成地点释放的刺激物导致的。但是，只有部分研究揭示了血液凝结活化和微循环系统间的关系。在本研究中，我们使用MC-FAN来分析在实验中微通道的血液凝结状况，并且评价在微通道中LPS刺激如何造成和加速微血栓的形成。因为MC-FAN系统可以在显微镜下直接分析微通道中形成的全血凝结，我们可以观测到血细胞是如何不经复杂过程附着到纤维蛋白块或者是活性血小板上的。因此，这种实验方法可以作为发现血栓形成的全新分子机理和全新的治疗血栓通用制剂的有效方法。目前的数据显示，MC-FAN可以检测导致微血栓形成的病因和条件，并且可能是一种检测MOF和DIC的超凝结性的有效诊断系统，并且可以以图像显示出抗凝结合抗血小板剂的有效性。
LPS会增加单核细胞的TF合成，进而导致动脉系统的超凝结（hypercoagulability）
[15]。在本研究中，我们通过多种抗凝剂和抗血小板剂来阻碍MC-FAN中LPS处理全血的流动速度减慢。理论上讲，干扰凝结对患有MOF的病人有好处。实际上，实验和临床证明表明诸如heparin[16]、hirudin派生物[17]、APC[18]、抗血栓剂[19]、TRPI[20]和sTM的抗凝剂都会部分阻碍发炎反应和血液凝结。另外，在本研究中，抗TF抗体是阻止在LPS刺激全血中产生凝结的最有效制剂。这些发现都暗示，通过抗凝剂（尤其是抗TF抗体）的治疗可能对MOF患者和部分的血栓栓塞或纤维蛋白过渡沉积患者有效。
在本研究中我们评价了凝血指标、TAT复合体在LPS刺激全血中的形成。基于这些指标的浓度改变，抗血栓剂可以消减在MC-FAN中的血液流动速度的降低。虽然每种抗凝和抗血小板剂都可以促进血液的流速，但是其机理看起来不尽相同。这就表示由于毛细血管中的堵塞导致的血栓形成，可能是由于纤维蛋白和血小板凝聚共同导致的。因而只测定血浆中的凝血指标对于获取造成MOF和/或DIC的危险因素是远远不够得。这样，在毛细血管中的血栓形成应该使用本实验中应用的化验系统进行。
血液凝结性和停滞性的变化在分析诸如静脉血栓和肺部栓塞等的血栓病症的发病原理上有着重要的作用[22,23]。血液流速的降低，可能会造成血管内内皮细胞剪切压的下降。但是对于血液流速和血液凝结活性的关系，以及在其中PBMC起到的作用，我们还所知甚少。本分析系统可以将血细胞活性作为血液流变性指标重点一项，分析血液的凝结性。因而，本系统可能可以检测由于血液流动性下降而造成的动脉和/或静脉血栓。
总而言之，我们建立了一种使用MC-FAN来进行微血栓形成的实验化验系统，可以有效地分析血液凝集和微血栓形成之间的关系。我们的反先暗示TF在PBMC上的表现会造成微血栓，而且抗凝剂和抗血小板剂耨可以有效的抑制微血栓的形成。在本研究中涉及到的分析系统可以在研制抑制微血栓形成药物以及说明MOF的机理上，可能有着显著的作用。
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