(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 105181423 A (43)申请公布日 2015.12.23
(21)申请号 201510631201.6(22)申请日 2015.09.29
(71)申请人上海太阳生物技术有限公司
地址201108 上海市闵行区金都路3419号(72)发明人谢永华 朱美萍 许付
(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限
公司 11227
代理人赵青朵(51)Int.Cl.
G01N 1/30(2006.01)
权利要求书1页 说明书7页 附图2页
(54)发明名称
碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)(57)摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。本发明所述试剂盒包括pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。本发明以碱性磷酸酶底物替代现有萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐等进行NAP染色，该底物化学结构中通过引入发色基团联苯基，增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度和阳性染色。
C N 1 0 5 1 8 1 4 2 3 A CN 105181423 A
权 利 要 求 书
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1.一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒，其特征在于，包括pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机盐。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述基质缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种。
4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠或氯化镁。5.根据权利要求1-4任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括固定液、重氮盐和苏木素复染液。
6.一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色方法，其特征在于，包括：步骤1、向新鲜待测血液涂片滴加固定液固定，固定后水洗待干；步骤2、将重氮盐置入pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液中完全溶解，混合成为染色工作液，将固定后血液涂片置入染色工作液中孵育，之后流水冲洗，取出待干；
步骤3、向血液涂片中滴加苏木素复染液复染，水洗待干，镜检；其中，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。
7.根据权利要求6所述染色方法，其特征在于，重氮盐与N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的摩尔浓度比为2:1～8:1。
8.根据权利要求6所述染色方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机盐。
9.根据权利要求8所述染色方法，其特征在于，所述基质缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种。
10.根据权利要求8所述染色方法，其特征在于，所述无机盐为氯化钠或氯化镁。
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说 明 书
碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)
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技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)，即一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。
[0001]
背景技术
碱性磷酸酶(NAP)主要存在于成熟中性粒细胞，是一种胞内非特异性水解酶，在碱性条件下能水解多种磷酸酯。随着细胞的成熟，NAP的活性也逐渐增强。在病理情况下，不同疾病及疾病的不同阶段均可引起NAP成分与含量的变化，因此，作为快速测定碱性磷酸酶活性的化学染色法经常被用作各种疾病的临床辅助诊断指标。NAP活性变化对某些疾病的鉴别与诊断具有重要的临床价值：当患有慢性粒细胞白血病时(无继发感染时)，其活性显著减低，缓解期可恢复至正常范围，加速期和急变期时，NAP活性可不同程度增高，该检测可作为观察慢粒白血病疗效和预后的一项指标，也是与类白血病反应鉴别的重要检测项目。急性粒细胞白血病，NAP活性降低，并发感染时可稍增高。NAP活性减低还常见于病毒感染或寄生虫、立克次体感染，恶性组织细胞增生症和淋巴瘤等。至于中性粒细胞碱性磷酸酶活性增高的情况则比较多见，如妊娠16W～20W孕妇，NAP水平显著增高，其他如细菌性炎症、类白血病反应、再生障碍性贫血、特发性血小板减少性紫癜、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、急性淋巴细胞白血病等也伴随有NAP积分增高现象。
[0003] 碱性磷酸酶的染色方法主要有金属盐沉淀法和偶氮偶联法。[0004] 金属盐沉淀法中最经典的是Gomori的钙钴法，其原理是以β-甘油磷酸为底物，在pH9.3的碱性条件下水解为磷酸钠和甘油，磷酸钠与钙离子作用生成磷酸钙，再与钴离子作用生成磷酸钴，后者与硫化铵作用生成不溶性硫化钴沉淀。由于钙钴法存在操作繁琐、费时、有特殊不良气味、硫化铵污染等缺点，目前医疗临床上已经很少应用。
[0005] 1955年kaplow LS提出了用偶氮偶联法对细胞中的碱性磷酸酶进行染色，其原理是利用碱性磷酸酶在pH9.2-9.8的碱性环境下，水解α-磷酸萘酚钠，产生α-萘酚，后者与重氮剂偶联成有色沉淀物的原理进行染色。但是，α-萘酚为未取代萘酚，与偶氮的有效偶联需要加入过量的重氮盐，对酶活性可能造成阻抑作用，其分解产物对细胞具有非特殊性染色作用，且每次试验需要临时配制孵育液。后期有许多学者找到了α-磷酸萘酚钠盐的替代品，如萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐，应用该方法染色具有快速、简便、容易重复等优点，但始终存在阳性染色不明显、显色灵敏度偏低等问题。
[0002]
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)，即一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法，使所述试剂盒以及染色方法应用于血细胞内碱性磷酸酶检测时能够提高阳性染色效果。
[0006]
本发明的另一个目的在于提供一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色
方法，使所述试剂盒以及染色方法应用于血细胞内碱性磷酸酶检测时能够提高显色灵敏
[0007]
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说 明 书
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度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：[0009] 一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒，包括pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。
[0010] 作为优选，所述N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺浓度为0.125mg/ml～1mg/ml，更优选0.25mg/ml～0.5mg/ml，其分子结构如下：
[0008] [0011]
与传统较常用的底物萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐相比，本发明试剂采用的底物在原有发色基团萘甲酰的N位上引入了另一发色基团联苯基，且在联苯基的2位和5位分别用助色基团甲基和甲氧基取代，可以增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度。
[0013] 所述碱性磷酸酶底物N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的合成方法为：以2-羟基-3-萘甲酸(化合物1)和5-甲基-4-苯基邻茴香胺(化合物2)为原料，三氯化磷为羧基和氨基的缩合剂，获得3-羟基-N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-2-萘甲酰胺(化合物3)；再通过五氯化磷磷酸化，最终获得N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺(化合物4)。[0014] 合成路线如下：
[0012] [0015]
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[0016] 作为优选，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机
盐。
其中，所述基质缓冲液优选自Tris-HCl缓冲液、2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种；[0018] 所述基质缓冲液浓度优选为0.1M；[0019] 所述无机盐优选为氯化钠或氯化镁；[0020] 所述无机盐浓度优选为0.1M。[0021] 所述稳定剂优选为甘油、PVP或TWEEN20，防腐剂优选为NaN3。[0022] 作为优选，本发明所述试剂盒还包括常规NAP染色一般都会具备的固定液、重氮盐和苏木素复染液。[0023] 其中，所述固定液选自1％～30％(v/v)甲醛甲醇、30％～80％(v/v)丙酮-枸缘酸溶液、70％～95％(v/v)甲醇中的一种，更优选1％～30％(v/v)甲醛甲醇，尤其优选10％～20％(v/v)甲醛甲醇；
[0024] 所述重氮盐选自固红TR盐、固黑K盐、固蓝BB盐、固红GBC盐、耐晒猩红R盐、固红紫LB盐、固紫B盐、固暗蓝R盐、固蓝B盐、新品红溶液中的一种，更优选固红TR盐、固紫B盐、耐晒猩红R盐。
[0025] 苏木素复染液可按照本领域常规方法用苏木精配制，或直接市售购买。本发明所述苏木素复染液优选含有如下试剂：0.05％～1％(w/v)苏木精，10％～50％(v/v)无水乙醇，0.01％～0.1％(w/v)碘酸钠，10％～50％(v/v)甘油，0.5％～5％(w/v)硫酸铝钾，0.5％～10％(w/v)枸缘酸，其余为蒸馏水。复染液pH范围为1.8～2.9。
[0026] 上述苏木素复染液中苏木精与碘酸钠的比例可以为1:0.05-1:1，优选1:0.1-1:0.5，尤其优选1:0.1-1:0.2。
[0027] 根据本发明提供的适用于血细胞碱性磷酸酶染色的试剂盒产品，本发明还提供一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色方法，包括：[0028] 步骤1、向新鲜待测血液涂片滴加固定液固定，固定后水洗待干；[0029] 步骤2、将重氮盐置入pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液中完全溶解，混合成为染色工作液，将固定后血液涂片置入染色工作液中孵育，之后流水冲洗，取出待干；
[0017]
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步骤3、向血液涂片中滴加苏木素复染液复染，水洗待干，镜检；[0031] 其中，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。[0032] 作为优选，上述染色方法还可以进一步为[0033] 步骤1、向新鲜待测血液涂片滴加4℃预冷的固定液固定30秒，固定后水洗待干；[0034] 步骤2、将重氮盐置入pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液中完全溶解，混合成为染色工作液，将固定后血液涂片置入染色工作液中37℃孵育30分钟，之后连缸流水冲洗1-5分钟，取出待干；[0035] 步骤3、向血液涂片中滴加苏木素复染液，室温复染1-2分钟，水洗待干，镜检。[0036] 作为优选，重氮盐与N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的摩尔浓度比为2:1～8:1，在本发明的一些实施例中，重氮盐与N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的摩尔浓度比为3.58:1。[0037] 作为优选，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机盐。
[0038] 其中，所述基质缓冲液、稳定剂、防腐剂、无机盐、固定液、重氮盐和苏木素复染液可参照试剂盒中优选的技术方案。
[0039] 在和现有的NAP染色方法的对比试验中，本发明染色效果为细胞核为蓝色，胞浆中出现红色沉淀，胞核和胞浆染色颜色鲜艳、对比清晰、鲜明。而对比的现有方法胞浆中出现红色沉淀颜色较淡，与细胞核的颜色对比并不鲜明。[0040] 同时，在检测急性淋巴细胞白血病、细菌性感染、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤、阵发性睡眠性血红蛋白尿病、慢性粒细胞性白血病和恶性组织细胞病共169例患者的NAP活性试验中，本发明能够显著增加患者NAP染色阳性率结果，表明本发明试剂盒和染色方法灵敏度更高，增加阳性染色。[0041] 由以上结果可知，本发明以碱性磷酸酶底物替代现有萘酚AS-BI磷酸钠盐、萘酚AS-MX磷酸钠盐等进行NAP染色，该底物化学结构中通过引入发色基团联苯基，增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度和阳性染色。附图说明
图1所示以本发明NAP染色方法的正常人外周血细胞涂片的镜检结果；
[0043] 图2所示以本发明NAP染色方法的妊娠17周孕妇外周血细胞涂片的镜检结果；[0044] 图3所示以现有NAP染色方法的正常人外周血细胞涂片的镜检结果；
[0045] 图4所示以现有NAP染色方法的妊娠17周孕妇外周血细胞涂片的镜检结果。
[0042]
具体实施方式
[0046] 本发明实施例公开了一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和
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范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0047] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法进行详细说明。[0048] 实施例1：N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺的合成[0049] 将54g(0.29mol)2-羟基-3-萘甲酸、600ml无水二甲苯、57g(0.27mol)5-甲基-4-苯基邻茴香胺依次加入1L带有蛇形回流冷凝管的三颈玻璃瓶中，80℃水浴搅拌10min，加入0.09mol三氯化磷，回流2h；趁热收集上清液，冷却析出沉淀，过滤除滤液；依次用二甲苯和蒸馏水清洗沉淀；将沉淀放入3％HCl水溶液中，加热后过滤得滤液，再次将滤液冷却析出沉淀，用热蒸馏水清洗沉淀后，将沉淀烘干，再结晶过滤，获得黄色的3-羟基-N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-2-萘甲酰胺中间体。
[0050] 将19.17g(0.05mol)上述中间体溶解于600ml二氧六环，向溶液中加入46.8g(0.22mol)五氯化磷，50℃水浴搅拌1h；将其缓慢倒入1.2L冰蒸馏水中，形成结晶，将晶体过滤烘干后，向其加入少量N,N′-二甲基甲酰胺，使晶体完全溶解；将溶液移入0.1mol/L的碳酸钠溶液中，0℃水浴搅拌2h后抽滤，将滤液再用0.45μm滤膜抽滤一次；向滤液中加入3N HCl再结晶，过滤得晶体，用蒸馏水洗晶体，将晶体过滤烘干后得4.6g N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺终产物。将所得终产物经核磁和红外检测，其核磁谱图和红外结果显示与预期结构一致。[0051] 实施例2：本发明试剂盒的组成和制备[0052] 固定液：10％甲醛甲醇试剂，以2.5ml/瓶分装；[0053] 重氮盐：固紫B盐，以30mg/瓶分装[0054] 碱性磷酸酶底物溶液：180mg N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺溶解于3ml DMF，将其加入到600ml含有0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl溶液中，调整pH值到9.3，并以30ml/瓶分装。[0055] 苏木素复染液：1.0g苏木精，25ml无水乙醇，0.1g枸缘酸，50ml甘油，5.0g硫酸铝钾，0.1g碘酸钠，50ml蒸馏水。[0056] 配制方法：将苏木精溶于25ml无水乙醇中，当苏木精溶解后，将甘油加入并摇动容器；硫酸铝钾研磨并加热，然后溶解于蒸馏水中，将其缓慢加入上边的溶液，并不断摇动，煮沸后，加入碘酸钠和枸缘酸，再煮沸后冷却过滤，此时pH值约为2.5。[0057] 实施例3：本发明染色方法[0058] (1)固定：向新鲜涂片滴加4℃预冷的固定液30秒，水洗待干；[0059] (2)染色：将1瓶重氮盐试剂(30mg，0.068mmol)置入1瓶碱性磷酸酶底物溶液(8.96mg，0.019mmol)中完全溶解混合成为工作液，将固定后涂片置入工作液中，37℃孵育30min，之后连缸流水冲洗1-5分钟，取出待干；[0060] (3)苏木素复染：向涂片中滴加苏木素，室温复染1～2分钟，水洗待干，镜检。[0061] 实施例4：现有NAP染色方法[0062] 1、现有碱性磷酸酶染色试剂的制备NAP固定液：为10％甲醛甲醇试剂[0064] 碱性磷酸酶底物溶液：180mg萘酚AS-BI磷酸钠溶解于3ml DMF中，将其加入到600ml含有0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl溶液中，调整pH值到9.3，并以30ml/瓶分装。
[0063]
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苏木素复染液：1.0g苏木精，25ml无水乙醇，0.1g枸缘酸，50ml甘油，5.0g硫酸铝钾，0.1g碘酸钠，50ml蒸馏水。[0066] 配制方法：将苏木精溶于25ml无水乙醇中，当苏木精溶解后，将甘油加入并摇动容器；硫酸铝钾研磨并加热，然后溶解于蒸馏水中，将其缓慢加入上边的溶液，并不断摇动，煮沸后，加入碘酸钠和枸缘酸，再煮沸后冷却过滤，此时pH值约为2.5。[0067] 2、现有碱性磷酸酶染色方法[0068] (1)固定：向新鲜涂片滴加固定液(4℃预冷)30秒，水洗待干；[0069] (2)染色：将1瓶重氮盐试剂置入1瓶碱性磷酸酶底物溶液中完全溶解混合成为工作液，将固定后涂片置入工作液中，37℃孵育30min，之后连缸流水冲洗数分钟，取出待干；
[0070] (3)苏木素复染：向涂片中滴加苏木素，室温复染1～2分钟，水洗待干，镜检。[0071] 实施例5：血细胞涂片碱性磷酸酶染色效果
[0072] 分别取正常人和妊娠17周孕妇外周血制作血涂片，按照实施例2和3中染色方法使用本发明试剂盒对血涂片进行染色，染色后的血涂片用油镜观察现象并拍照，如图1和图2。
[0073] 同时，采用实施例4的NAP染色方法对正常人和妊娠17周孕妇外周血的血涂片进行染色镜检效果对比，结果见图3和图4。[0074] 染色结果对比：阴性反应(图1和图4中可见阴性细胞)，细胞核为蓝色，胞质无异常着色或颗粒。本发明染色阳性反应(图1、图2)，细胞核为蓝色，胞浆中出现明显的红色沉淀，胞核和胞浆染色颜色鲜艳，对比清晰、鲜明。现有NAP染色的阳性反应(图3和图4)，胞浆中出现的红色沉淀颜色较淡，与细胞核的颜色对比并不鲜明。[0075] 实施例6：阳性染色以及显色灵敏度对比试验
[0076] 仍以实施例2和3的本发明染色试剂盒和方法以及实施例4的现有染色法为比较对象。
[0077] 从医院随机抽取正常人和患者的新鲜外周血涂片共241份，其中正常人72例，疾病患者169例。分别用本试剂盒试剂和传统偶氮偶联法试剂进行染色制片，计算各个涂片中性粒细胞NAP染色的阳性率和积分，计算方法如下：[0078] 1)染色结果分级：观察100个中性粒细胞，视其细胞内碱性磷酸酶活力强弱，按五级记分表示，标准如下：
[0079] ①中性粒细胞胞浆无异常着色或颗粒，为0分；[0080] ②胞浆内呈弥散的浅红色，或少许细微颗粒，为1分；[0081] ③胞浆内有红色散在颗粒，为2分；[0082] ④胞浆内有分布不均匀的深红色颗粒，为3分；[0083] ⑤胞浆内充满了均匀一致的深红色颗粒，或块状沉淀，为4分。[0084] 2)阳性率：100个中性粒细胞中，级数1以上细胞的百分数；[0085] 3)积分：100个中性粒细胞中，将每级阳性细胞百分比乘以该级的分数所得分数之和，即为碱性磷酸酶的积分。正常人外周血涂片NAP染色后，计算阳性率和积分的平均值及分布范围，分别为：传统偶氮偶联法试剂阳性率为25.4％(15.3％～43.3％)，积分为35.95(18.3～53.4)；
[0086]
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说 明 书
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本发明试剂盒阳性率为28.78％(16.4％～48.1％)，积分为36.97(19.2～69.8)。[0087] 疾病患者外周血涂片NAP染色后，计算阳性率和积分的平均值及标准差(S)，结果见表1。
[0088] 表1 169例疾病患者两种NAP染色方法的结果比较
[0089]
结果显示：本发明试剂检测急性淋巴细胞白血病、细菌性感染、再生障碍性贫血、
多发性骨髓瘤等疾病NAP活性显著升高；阵发性睡眠性血红蛋白尿病NAP活性显著降低，慢性粒细胞性白血病和恶性组织细胞病的阳性率接近为零，说明本发明试剂盒的染色结果可靠、稳定。
[0091] 同时，从上述与传统方法相比的结果中可以看出，本发明试剂盒在患者血细胞涂片染色检测中，对于弱阳性细胞也能分辨，阳性率稍高，显色灵敏度更高；操作更加简单、方便。因此，本发明试剂盒可在临床上血细胞NAP染色辅助诊断推广应用。
[0092] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
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说 明 书 附 图
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图2
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说 明 书 附 图
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图3
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