a)
生物大分子的化学结构、大小、形状和三维结构，以及大分子之间的相互作用。
b)
生物大分子结构与功能的关系，以及生物学现象的分子生物学过程。
c)
生物大分子在细胞成分中的组织结构方式，活细胞在合成大分子时的物理化学过程。
d)
生物信息传递和代谢调节的分子生物学过程
二、生物化学与分子生物学的关系与区别
❖
分子生物学从分子水平研究生命现象，生物化学从分子水平研究生命化学现象，二者互相渗透。
❖
分子生物学主要研究核酸、蛋白质和其他大分子的结构和功能，以及其相互作用，着重遗传信息传递和代谢调节问题。生物化学代谢过程。
❖
分子生物学采用物理学、生物化学和遗传学相结合的方法，生物化学采用生物化学和化学的研究方法
三、分子生物学研究方法
❖ ❖ ❖ ❖ ❖
X射线衍射法 核磁共振技术 基因表达谱研究技术 DNA芯片技术 蛋白质谱研究技术
第 1 页
❖
蛋白质鉴定的数据库搜索法
第二章 遗传信息的传递 1．.中心法则的基本内容 2．核酸的化学组成 3．DNA的二级结构 4．DNA的超螺旋结构 二． 维持DNA双螺旋的力 1．氢键
❖
GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，这是DNA双螺旋结构的重要特征之一，DNA的许多物理性质如变性、复性以及Tm值等都与此有关。
2.碱基堆集力 ： DNA同一条链相邻碱基之间的非特异性作用力，包括疏水作用力和范德华力。 氢键与碱基堆集力的协同作用
❖
已经堆基的碱基更容易发生氢键的键合，相应地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。
❖
两种作用力相互协同，形成一种非常稳定的结构。如果一种作用力被消除，另一种作用力也大为减弱。
3.不稳定因素
磷酸基团间的静电斥力
带负电荷的磷酸基的静电斥力，所以DNA需要保存在含 Na+ 生理盐条件 。
第 2 页
碱基分子内能
物体的内能是物体内全部分子的分子动能与分子势能之和。 温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏，消弱了碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，会使DNA的双螺旋结构受到破坏
三．变性(denaturation
概念：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程。 1.常用的变性方法 热变性
应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 碱变性
pH11.3时，全部氢键被淘汰
无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法 2.核酸变性程度的鉴定－紫外测定法：
❖ ✓
原理：
嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处
✓
紫外光吸收值：
1 双链DNA A260=1.00 2 单链DNA A260=1.37
第 3 页
3 自由碱基 A260=1.60 3.熔解曲线与Tm值
缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到 0.1 ℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线 熔链温度Tm：
OD增加值的中点温度(一般为85-95℃) 或DNA双螺旋结构失去一半时的温度 4.影响DNA Tm值大小的因素
❖
G-C含量：
Tm值计算公式：Tm＝69.3+0.41 (G+C)%
GC%=（Tm-69.3）×2.44
❖ ❖
介质中的离子强度：
DNA保存在高浓度的缓冲液中，如 1mol/LNaCl中。
5.DNA复性(renaturation)
❖
变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象，又称为退火（annealing
❖
DNA的复性的条件有两个：
（1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力；
（2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高，
❖
一般使用比Tm值低20－25℃ 。
复性的机制
❖
一般认为需要10－20个碱基对，特别是富含GC的节段首先形成一
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个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构 6.复性的影响因子：
❖ ❖ ❖ ❖ ❖
温度和时间：低于Tm值 25℃左右 (60-65℃) DNA浓度： DNA片段的大小： DNA顺序的复杂性； 反应溶液中的离子强度
四．DNA的超螺旋结构(三级结构
绝大多数原核生物及病毒的完整DNA分子都是共价封闭环(covalently closed circle, CCC)分子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋.
真核生物线状DNA与蛋白质结合以环状的形成存在。 超螺旋结构是DNA三级结构的主要形式。
超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。
DNA生物合成 1.DNA复制方式：
❖
半保留复制
子代DNA分子双链的一条链总是来源于亲代DNA，采用半保留方式复制，原核生物及真核生物都采用该方式。
❖
DNA复制属性
复制原点、复制子、复制叉、复制速度。
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2.DNA复制酶学基础
❖ ❖ ❖ ❖
底物(dAMP\\dGMP\\dCMP\\dTMP)和dNTP 模板 DNA聚合酶
其他酶和蛋白质因子
3.DNA复制过程
❖ ❖ ❖
复制起始 复制的延伸 复制的终止
4.原核生物和真核生物DNA复制的比较 相同点：
1）半保留复制方式 2）半不连续复制 3） DNA 螺旋酶, SSBP 4） RNA 引物 不同点：
1） 复制起点（单、多） 2）复制子（大小、多少） 3）复制叉移动的速度 4）冈崎片段的大小 5）端粒和端粒酶 6）DNA聚合酶
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RNA生物合成 1.原核生物转录机制 终止子
不依赖ρ因子/强终止子
(1) 一个反向重复序列， 可形成茎环结构，阻止RNA pol的前进； (2) 茎区域内富含G-C，使茎环不易解开；
(3) 3’端上有6个U，和模板形成的连续U-A配对较易打开，便于RNA释放。
2.真核生物转录机制 依赖ρ因子
❖
(1) 没有固定的特征，也可形成茎环结构，但不是都能形成稳定的发夹；
❖ ❖ ❖ ❖
(2) 茎中的G、C含量少。 (3) 3’端寡聚U数量不定；
(4) 靠与ρ的共同作用而实现终止。
茎环的存在可使RNA聚合酶暂停一下，若此时ρ因子追上来和其结合，那么转录即可终止，若无ρ因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。
3.原核前体mRNA的加工
❖
原核生物的mRNA很少经过加工，由于转录和翻译偶联，一般情况下一边转录一边就进行翻译，中间没有可加工的间歇时间。
❖
但在少数情况下多顺反子mRNA先被内切酶切成较小的单位再作为
第 7 页
翻译的模板。
4.真核生物前体RNA的加工
1. 2. 3. 4. 5.
5’端加帽
3’端的产生和多腺苷酸化 mRNA内部甲基化 RNA剪接 RNA编辑
遗传密码 1.通用三联体密码
1. 密码子的简并性
2. 密码子的通用性和特殊性 3. 密码子的阅读方向 4. 密码子与反密码子的作用
反密码子
与mRNA相应的三联体密码子碱基互密反补
▪ 摆动性：mRNA密码子的前两位碱基和tRNA的反密码严格配对，而
密码子第三位碱基与反密码子第一位碱基不严格遵守配对规则。 tRNA 1.tRNA结构 三叶草结构 2.tRNA的功能 1)解读mRNA的遗传信息
第 8 页
2)运输的工具，运载氨基酸 tRNA有两个关键部位：
● 3’端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。 ●与mRNA结合部位—反密码子部位 3.氨酰– tRNA合成酶（AARS ）
★模板mRNA只能识别特异的tRNA而不是AA。
★氨基酸进入蛋白质合成途径是通过氨酰-tRNA合成酶(AARS) ，这种酶将氨基酸和特异的tRNA连接起来，成为氨基酰tRNA 。
原核生物中AARS有20种，对AA及tRNA高度专一，准确结合；
★ 大小：40kDa~100kDa之间，有单聚体、二聚体和四聚体。 4.AARS 识别tRNA的反应：
★ 需要三种底物 AA tRNA ATP ★ 因此有三个位点
AA binding site tRNA binding site ATP site ★ 反应：
活化：氨基酸+ATP+E→氨基酰-ATP-E+PPi 转移：氨基酰-ATP-E +tRNA→aa-tRNA+AMP+E 5.翻译过程 1 起始 组成过程：
第 9 页
30S+50S+mRNA+fMet- tRNAfmet
70S-mRNA-fMet- tRNAfmet+GDP+Pi 起始复合物--- 70S三元复合物 起始因子(Initiation factor，IF）
❖ Ecoli 三种: IF1 IF2 IF3 。 ❖ IF的性质特点：
不同 IF 形式 MW GTP结合 能力 IF-1 9500 - IF2和IF3的活性作用。 IF-2a IF-2 IF-2b 85000 117000 + 与前起始复合物结合形成30S三元复合物 1. 使得30S与mRNA结合，IF-3a 20668 IF-3 IF-319997 β 颗粒解离为30S和50S亚基。 30S 亚基与mRNA的结合
IF3+30S- - 30S---IF3 + mRNA-- 30S---IF3---mRNA（30S复合物） ☆ IF3－－赋予30S 亚基与mRNA 结合的能力。
第 10 页 - 2.解离活性，使70S核糖体形成前起始复合物 。 生IF-2.GTP.fMet-tRNAfmet成无特异功能，但具有加强 生物学活性 （30S亚基没有与mRNA主动结合的能力） ☆ IF3 使30S 亚基不能与50S亚基结合，保证解离状态 ☆ 30S 亚基与mRNA 的结合。
SD（5’-AGGAGG-3’）与
16S rRNA
的 3’ 端
(3’-UCCUCC-5’）,使AUG定位在P位上。
☆ 30S 复合物中，起始密码子位于P位点，只有fMet-tRNAfMet能进入
起始 tRNA 的结合
IF2 + fMet-tRNAf ——IF2---fMet-tRNAf＋ 30S---IF3---mRNA---- 30S---IF3---mRNA---IF2---fMet-tRNAf---GTP 70S 起始复合物的形成过程 a、 IF3先游离
30S---IF3---mRNA---IF2---fMet-tRNAf---GTP与50S亚基的结合导致。
b、 70S 起始复合物形成
◎ 50S亚基的结合激活IF2 的GTP酶活性，水解GTP并解离下来（IF1、IF2 ）。
◎ GTP水解释放的能量改变两者的构象形成70S 起始复合物： 30S---mRNA---fMet-tRNA---50S
c、 Met的甲酰基除去…..合成到15～30个AA ◎ 去甲酰基酶（细菌、线粒体）； ◎ 氨肽酶去除Met。
第 11 页
2 延伸
延伸的三个阶段：
⑴ 进位反应：主要是密码子-反密码子的识别； ⑵ 转肽反应：肽链的形成；
⑶ 移位反应：tRNA和mRNA相对核糖体的移动。 1)进位
❖ 氨基酰-tRNA与核糖体结合，进入A位的过程。 ❖ 过程：
3 终止
➢ 包括：肽链释放， tRNA逐出，核糖体与mRNA解聚。
3.1 终止密码UAA,UGA,UAG； 3.2 释放因子(releasing factor,RF)
GTP结释放因子 MW 合能力 RF1 RF2 36000 识别UAA和UAG 识别UAA和UGA 刺激RF1，RF2的活性, 与GTP结合，使转肽酶构象改变，RF3 46000 + 发挥酯酶活性，水解多肽、脱离tRNA 终止过程
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生物学活性 38000 a. RF1、RF2 作用于A 位点（P 位被肽酰-tRNA 所占据），识别终止密码子；
b. RF3 作用改变肽基转移酶构象，从而改变肽基转移特性，发挥水解酶作用，将肽链从结合在核糖体上的tRNA的CCA末端上水解下来， mRNA与核糖体分离，tRNA脱落。
c. RF3 与 GTP 结合为肽基转移及随后的核糖体释放提供能量。 d. 同时核糖体在IF-3作用下，解离出大、小亚基
❖
mRNA翻译的多肽链没有功能，称为新生蛋白质或蛋白质前体，需要经过加工改造才能成为有功能的蛋白质。
❖ ❖
mRNA的信息阅读：5’端向3’端， 肽链延伸：从N端到C端。
真核生物的基因组结构
一． 真核生物基因组的大小 二． 真核生物基因组的基因数量
三． 真核生物基因组的非重复序列和重复序列 四． 细胞器基因组
真核生物基因组的非重复序列和重复序列：
1. 2. 3.
高度重复序列 中度重复序列 非重复序列
细胞器基因组： 1.线粒体基因组
第 13 页
2.叶绿体基因组 第二节 断裂基因
一． 断裂基因由外显子与内含子组成 二． 外显子 三． 内含子
第三节 基因家族和基因簇
一． 基因家族 1. 2. 3. 4.
基因家族的成因 基因家族的特点 假基因 常见基因家族
第四节 真核生物基因组的包装 一.染色质的结构单位：核小体 由核心颗粒和连结DNA两部分组成：
① 每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1； ② 组蛋白核心：由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体；
③ DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合；
④ 相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA。 第五章 原核生物基因的表达调控 第一节 基因表达调控的概念
基因表达：储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个
第 14 页
过程。
❖
基因表达调控：对基因表达过程的调节。
生物的基因表达不是杂乱无章的，而是受着严密、精确调控:
1.5 原核生物基因表达调控环节： ① 转录水平上的调控； ② 转录后水平上的调控：
a. b.
mRNA加工成熟水平上的调控 ； 翻译水平上的调控 。
2 结构基因和调控基因
➢ ➢
结构基因（structural gene）：编码蛋白质或RNA的任何基因。 原核生物的结构基因一般成簇排列，真核生物独立存在。
调控基因（regulator gene）：参与其他基因表达调控的RNA或蛋白质的编码基因。
➢
其编码产物与DNA上的特定位点结合调控基因表达
第二节 大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控 一、操纵子与操纵子模型
原核生物基因表达调控主要发生在转录水平，转录调控的基本单元是操纵子。
1、操纵子的概念：根据操纵子学说，很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列，由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子
❖
2、操纵子结构
第 15 页
由启动子（P）、操纵基因（O）、调控基因、结构基因所组成。 二、正调控与负调控
❖
1、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)，激活蛋白结合与DNA的启动子及RNA聚合酶后，转录才会进行。
（1）在正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行。
（2）在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行
2、在负转录调控系统中，调节基因的物质是阻遏蛋白(repressor)－－阻止结构基因转录。其作用部位是操纵区。它与操纵区结合，转录受阻。 （1）负控诱导系统－－阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录。
（2）负控阻遏系统－－阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。 名词
❖ ❖ ❖ ❖ ❖ ❖ ❖
正调控 负调控 诱导 阻遏 激活蛋白 阻遏蛋白 诱导物
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❖
辅阻遏物
调控模式
1、可诱导负调控 2、可诱导正调控 3、可阻遏负调控 4、可阻遏正调控
三、大肠杆菌乳糖操纵子的负调控 （一）大肠杆菌的乳糖利用系统
大肠杆菌的乳糖代谢需要有β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的催化 。这种酶能把乳糖水解为半乳糖和葡萄糖 .另外有半乳糖苷透性酶和巯基半乳糖苷转乙酰酶。三种酶协同作用，使得乳糖得以分解和利用。 乳糖操纵子的结构和功能 结构 基因 操纵 基因 启动子 调节 基因 是结构基因的开关.通过对RNA聚合酶阻抑与否来控制结构基因的转录或停止. 是RNA聚合酶与DNA结合的部位,可识别转录起始点. 能产生阻遏物.通过阻遏物与操纵基因的结合与否来控制操纵基因的关闭和开启 3个不同结构基因能够产生3种不同的酶. 二）乳糖操纵子的调控机制
1、没有乳糖时，具有活性的阻遏物和操纵基因结合，转录不能进行。
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2、有乳糖时，乳糖与阻遏物结合，使阻遏物发生构象变化而失活，不能与操纵子结合，结构基因正常转录，进而再翻译出蛋白质。 四、大肠杆菌乳糖操纵子的正调控 1、葡萄糖敏感操纵子
有一些控制某一种糖如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖等分解代谢的操纵子，当培养基含有葡萄糖时，会阻止这些操纵子的功能，称为葡萄糖敏感操纵子。
例如：当大肠杆菌生长的培养基中既有葡萄糖又有乳糖的条件，只利用葡萄糖，而不利用乳糖。换句话说，只要在培养基中有葡萄糖存在，便可抑制了利用其他各种酶的产生，称为分解物阻遏。
❖
2、CAP-cAMP调控
另外一种起调节作用的诱导物为cAMP（环化腺苷酸） 分析一组实验几种情况：
（1）当培养基中含用大量葡萄糖时，cAMP水平明显下降。
（2）当以乳糖为唯一碳源时， cAMP水平明显上升，β-半乳糖苷酶的合成增加。
3）当有乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入cAMP ， β-半乳糖苷酶的合成速率大大提高。 结论：？
cAMP 浓度能影响到β-半乳糖苷酶的合成速率。主要是cAMP能激活CAP（分解物基因激活蛋白），起转录因子的作用。 3、lac操纵子的正调控机制
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（1） cAMP-CAP复合物与DNA结合，改变DNA结构，促进了RNA聚合酶结合区的解链，从而促进RNA聚合酶和启动子结合，使转录能力增强。 （2） cAMP-CAP复合物的形成取决于AMP的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP不能转化为cAMP， cAMP浓度下降，不能形成cAMP-CAP复合物，乳糖结构基因不能被转录。(因为细胞中有葡萄糖作为能源，就没有必要需要对乳糖利用的几种酶了)
❖
四、色氨酸操纵子的转录调控及衰减作用
1．色氨酸操纵子模型：
操纵子：包括色氨酸合成有关的5种酶的结构基因； 大量色氨酸时：大肠杆菌5种酶的转录同时受到抑制； 色氨酸不足时：这５种酶的基因开始转录；
色氨酸：作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构基因的转录。 ∴ trp操纵子是一个典型的可阻遏操纵元模型(repressible operon)。
❖
色氨酸操纵子模型结构：
5种结构基因：trpE、D、C、B、A；
调控结构：启动子、操纵子、前导序列、弱化子； 阻遏物trpR基因：与trp操纵子相距较远；
❖
2.色氨酸操纵子的负调控： ⑴. 阻遏调控：
trpR基因编码无辅基阻遏物 与色氨酸结合 形成有活性的色氨酸阻遏物 与操作子结合 阻止转录；
第 19 页
色氨酸不足：阻遏物三维空间结构发生变化 ，不能与操作子结合，操纵元开始转录；
色氨酸浓度升高：色氨酸与阻遏物结合，空间结构发生变化，可与操作子结合，阻止转录。
❖
⑵. 弱化子调控：
当有色氨酸存在而trp操纵子受抑制时，仍有一段前导序列发生转录，可能存在另一种的机制来抑制trp操纵元的转录。 色氨酸高浓度存在时，转录的前导序列140bp长，其中有一28bp的弱化子区域；形成发夹结构，为内部终止子，RNA酶从DNA上脱落，不能转录；
色氨酸低浓度或不存在时，RNA聚合酶能通过弱化子区域，转录完整的多顺反子mRNA序列；
第七章 基因突变和修复 第一节 基因突变 一、基因突变的类型
1. 2. 3. 4. 5.
碱基置换和移码突变
同义突变、错义突变和无义突变 自发突变和诱发突变 点突变和染色体变异 突变和回复突变
1.碱基置换和移码突变
❖
移码转换和颠换
第 20 页
❖
突变
转换（transition）:一种嘌呤-嘧啶对被另一种嘌呤-嘧啶对所替换。 颠换（transvertion）:一种嘌呤-嘧啶对被另一种嘧啶-嘌呤对所替换 。 移码突变（frame-shift mutation
基因组DNA链中插入或缺失1个或几个碱基对，从而使自插入或缺失的那一点以下的三联体密码的组合发生改变，进而使其编码的氨基酸种类和序列发生变化。
❖
无义突变（non-sense mutation）
碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码UAA、UAG或UGA。
❖
错义突变（missense mutation）
碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。 3.自发突变和诱发突变
❖
自发突变：主要来源于复制错误及DNA自发水解和脱氨等产生的自发损伤。（碱基的互变异构、脱氨作用、脱嘌呤脱嘧啶、碱基修饰与链断裂）
❖ ❖
诱发突变:物理、化学或生物因素诱发产生的突变。 碱基类似物
某些碱基类似物可以取代碱基而插入DNA分子引起突变 。
❖
芳香族化合物
吖啶类和焦宁类等扁平分子构型的芳香族化合物可以嵌入DNA的核苷酸序列中，导致碱基插入或丢失的移码突变。
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二、基因突变的特点
1. 2. 3. 4.
普遍性
基因自发突变频率很低（10-6-10-9） 多数基因突变对生物体有害 基因突变的随机性和不定向性
第三节 直接修复
一． DNA
聚合酶的校正功能
二． 嘧啶二聚体的光复活修复 三． 烷基转移酶介导的修复
一、 DNA聚合酶的校正功能
❖ ❖
原核生物DNA聚合酶3‘-5’外切校对活性 真核生物DNA聚合酶3‘-5’外切校对活性
第四节 错配修复系统
一． 错配修复系统根据不同甲基化程度识别模板链和新生链
第五节 切除修复系统
一． 碱基切除修复
1.DNA糖基化酶的作用 2.AP内切酶的作用 3.氧化碱基的修复 第六节 重组修复
一． 同源重组修复
第八章 基因重组和转座
第 22 页
第一节 同源重组
一、同源重组的分子机制
1.
同源重组的条件
交换区具有相同或相似的序列 双链DNA分子间互补配对 重组酶的存在 异源双链区的形成 二、同源重组的酶学机制 -Rec ABCD、 RuvABC途径
❖ ❖
Rec BCD蛋白在chi位点3’侧的一条链上产生切口。
Rec BCD蛋白同时具有解螺旋酶的活性，使chi位点附件切口的DNA解链
❖ ❖ ❖
单链区被Rec A蛋白和SSB蛋白覆盖
RecA 蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分
D－loop区域的DNA产生切口，新切口的3’端（ the tail of newly nicked DNA ）与另一条DNA的单链区互补配对
❖ ❖ ❖
DNA连接酶封闭切口，形成Holliday junction RuvA 和RuvB发动迁移反应 RuvC拆分重组中间体
第二节 位点特异性重组
❖
位点特异性重组最典型的列子是λ噬菌体对E.coli的整合。在裂解周期，λ DNA是以环状分子独立存在于细菌的细胞质中；在溶原化
第 23 页
状态时的λDNA是整合在细菌的染色体中。称为原噬菌体。通过位点特异性重组这两种状态是可以相互转变的。
❖
进入溶原状态时游离的λDNA必须整合（intergrated）到宿主的DNA中；从溶原周期进入裂解周期时原噬菌体DNA须从宿主的染色体中切离出来。
❖
噬菌体λ的整合和切离是在特异位点即附着位点(attatchment sites, att ) 通过重组完成的，若这个位点发生突变就会失去功能而抑制整合。
第三节 转座（transposition） 一、原核转座子的类型 .插入序列（IS）:
IS家族的结构：两端都有短的正向重复序列（direct repeats, DR），
略长的反向重复序列（inverted repeats，IR）以及1kb左右的编码区，它仅编码和转座有关的转座酶。
对靶的选择有三种形式：随机选择，热点选择和特异位点的选择。
2.复合转座子 ：
复合转座子含有一个中心序列和位于两侧的臂（arm）。 除了和自身转座有关的基因外，中心序列含有抗药性基因等遗传信息。
复合转座子两端的臂由IS序列组成。有的二侧组件相同（如Tn903），有的不同（如Tn10）。有的方向相同（如Tn9），有的方向相反（如Tn903，10，5）。有的皆有功能（如Tn903，
第 24 页
10），有的仅右侧组件有功能
3.Tn A家族:
❖ ❖
TnA是复制型转座的转座子。
长约5kb左右，中部的编码区不仅编码抗性基因，还编码转座酶和解离酶。
❖
两端具有末端反向重复序列，而不是IS，长约38bp左右，任一个缺失都会阻止转座。
❖ ❖
靶位点具有5bp的正向重复序列。 TnA家族都带有抗性标记
二．转座机制：
转座子插入到DNA上新的位点，首先交错切开靶DNA，再将转座子连接到靶DNA的凸出单链上，最后填补空缺完成转座。
使用参差不齐的末端是各种转座子的共同特点 根据转座子的机制，转座可分成三种不同的类型 ：
1. 2.
复制性转座 非复制型转座
这类转座因子直接从原位点移到靶位点,同时在供体留下产生一个双链断裂的位点。这种类型的机制只需要转座酶。这个双链断裂位点需要修复系统的识别和修复，否则将是致命的。
3．保守转座（conservative tranposition）
Conservative transposition involves direct movement with no
loss of nucleotide bonds
第 25 页
保守转座的转座因子从供体位点上切离，插入到靶位点上，供体位
点恢复原状。这种因子的转座酶和λ整合酶家族相关。 注意：
某些转座子只具有一种转座机制，而另一些可能具备两种途经,如
IS1和IS903 第九章 基因工程
基因工程：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基 因 DNA分子水平 剪切→拼接→导入→表达 人类需要的基因产物 第一节 工具酶及相关技术
一． 用于基因克隆的核酸酶 1. 2. 3.
宿主控制的限制与修饰 限制酶与修饰酶
限制修饰系统的类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ
第二节 基因工程的载体
载体(vector)是携带外源DNA 进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们
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一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。载体应具备以下条件： １、能在适当的宿主细胞中复制；
２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA 插入； ３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA 与宿主DNA 便于分离；
５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
宿主细胞是基因克隆中重组DNA 分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：
１、 对载体的复制和扩增没有严格的限制； ２、 不存在特异的内切酶体系降解外源DNA； ３、 在重组DNA 增殖过程中，不会对它进行修饰； ４、 重组缺陷型，不会产生体内重组； ５、 容易导入重组DNA 分子； ６、 符合重组DNA 操作的安全标准。 一、质粒载体
质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA 分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。 1.λ噬菌体
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是一种双链DNA 噬菌体，基因组约为50kb+。
线性λ噬菌体DNA 分子的两端各有12 碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。 2.Cosmid 载体
是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。 3.Phasmid载体
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）。其分子量一般都比M13载体的小，约为 3000bp，易于体外操作，可得到长达10kb的外源DNA的单链序列； 第三节 DNA克隆
一． 基因克隆的全过程 ① 获得目的DNA片段 ② 将目的片段连接到载体上
③ 将人工重组的DNA引导进入受体细胞 ④ 检出目的转化子 ⑤ 对目的转化子进行分析
第四节 原核生物基因克隆和鉴定
一． DNA文库构建
基因文库的概念 基因文库的克隆数
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不完全切割
二． 检出目的克隆 1. 平板杂交法 2. 免疫学检测 3. 遗传学检测
第五节 聚合酶链式反应
一． 引物 二． DNA聚合酶 三． RT-PCR
第六节 原核生物基因克隆的应用
一． DNA序列分析
二． 希望以上资料对你有所帮助，附励志名言3条：
三． 1、要接受自己行动所带来的责任而非自己成就所带来的荣耀。 四． 2、每个人都必须发展两种重要的能力适应改变与动荡的能力以
及为长期目标延缓享乐的能力。
五． 3、将一付好牌打好没有什么了不起能将一付坏牌打好的人才值
得钦佩。
六．
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