绿色荧光蛋白标记技术及其在基础临床研究中的应用

・４２０・　塞旦　壁　盘查　ｏ７　１２月第１ｏ卷第６期Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｈｅｐａｔｏｌ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２００７Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．６　．・综　述・　绿色荧光蛋白标记技术及其在基础临床研究中的应用＊　杨洁聂青和　【摘要】绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）作为一个监测完整细胞和组织内基因表达及蛋白定位的理　想标记物，在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光，且荧光性质稳定，与其它标记物相比，具有明显优　势。因而广泛应用于转基因动物的研究、融合标记、基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化、病原菌侵入活细胞　的分子过程等。ＧＦＰ作为新一代的基因转移报告物和／或定位标记物，在生命科学研究中越来越受到关注。　【关键词】　绿色荧光蛋白　基础与临床研究　１９９２年Ｐｒａｓｈｅｒ等¨１　克隆到ＧＦＰ的ｃＤＮＡ，１９９４年　Ｃｈａｌｆｉｅ等　首次在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的　绿色荧光蛋白，开创了应用绿色荧光蛋白标记技术的先河。　ＧＦＰ主要来自两种海洋无脊椎动物一西南太平洋水母（Ａｅ—　ｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）和佐治亚沿海水域的三色堇（Ｒｅｎｉｌｌａ　ｒｅｎｉｆｏ—　ｍｉｓ）Ｌ３　。它是一类存在于腔肠动物体内的发光蛋白，当受到紫　外光或蓝光激发时，能发射清晰可见的绿色荧光，且荧光性质　稳定，无种属限制。其次，ＧＦＰ的检测极其方便，将它与目的基　因连接后，转染进细胞，结合荧光显微镜、流式细胞仪或激光共　聚焦显微镜即可在活细胞中进行观察检测，对细胞几乎无伤　大吸收峰为３９５ｎｍ，另一小吸收峰为４７０ｎｍ，最大发射峰为　５０９ｎｍ，在５４０ｎｍ处有一肩峰。由于ＧＦＰ有高能量的Ｂ态和　低能量的Ａ态，存在能量的迁移，故ＧＦＰ基因表达后，一般有　几个小时的延迟期才能观察到绿色荧光。此外，水母和三色堇　的ＧＦＰ发光虽然均需要ｃａ激发，但二者的发光机理略有不　同：在水母中，钙离子和腔肠素结合到发光蛋白上，使荧光素被　氧化而释放出蓝光，继而激发ＧＦＰ发出绿色荧光；而三色堇是　由荧光素酶氧化荧光结合蛋白结合的荧光素产生蓝光并激发　ＧＦＰ产生绿色荧光。　三、ＧＦＰ的优点及不足　害。鉴于这些优点，近十余年来，ＧＦＰ已广泛应用于科研领域　及临床治疗，取得了一系列成果。本文就这一技术及其在基础　与临床研究中的应用作一简要综述。　一相比很多标记物，ＧＦＰ具有显著的优点：①性质稳定，对光　漂白具有高抗性，对光和热不敏感，能耐受６０￣Ｃ处理，在７５℃　时依然有５Ｏ　的ＧＦＰ保持活性＿５］。在４５０～４９０ｎｍ蓝光激发　、ＧＦＰ的结构特点　下，ＧＦＰ荧光至少能保持１Ｏ分钟以上。用甲醛固定后，荧光性　质也没有变化，不像其它荧光素，比较容易淬灭。②相对分子　质量小，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，　不影响与其连接目的基因的表达，也不影响融合蛋白的活性，　运用多波长分散定位法研究发现，ＧＦＰ是圆柱状结构，直　径约３ｎｍ，长约４ｎｍ，外围由１１个ｐ折叠片层链组成，内部围　绕包含一个　螺旋，两端由短ａ一螺旋片断封闭。其蛋白由２３８　个氨基酸组成，基因长２．６ｋｂ，含三个外显子，相对分子质量为　对受体细胞无毒害，细胞仍可连续传代培养，对抗原或抗体的　标记效率达到１００　。③作为荧光靶使用方便，不需加任何酶　和底物及辅助因子，即可行活细胞实时定位观察，更接近自然　真实的状态，又节省大量经费。④可根据不同实验目的选择不　同突变体用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等可进行活细胞实　时观察。⑤无物种特异性，荧光为该蛋白的内在属性。当然，　ＧＦＰ也存在一些不足，其生色团的坚固外层，在保护荧光不被　淬灭的同时也降低了对环境的敏感性。Ｗｅｉｎｇａｒｔ等　］的研究　发现，用ＧＦＰ作荧光标记的百日咳杆菌与用异氰酸荧光作标　记相比，前者被中性粒细胞吞噬的效率低于后者。Ｌｉｕ等口　发　现表达不同水平ＧＦＰ或其突变体ＲＳＧＦＰ、ＥＧＦＰ等的ＮＩＨ／　３Ｔ３、ＢＨＫ一２１、Ｈｕｈ－７及ＨｅｐＧ细胞，其乳酸脱氢酶的活性均低　于正常对照，且这些细胞中的～部分发生皱缩、变圆，乃至凋　２７０００。ＧＦＰ的蛋白性质极其稳定，能耐受高温处理，无光漂白　现象，用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。近年来，　为了改善ＧＦＰ的特性，使用ＰＣＲ和羟胺突变等方法获得了许　多ＧＦＰ的突变体，如增强型ＧＦＰ、突变体￥６５Ｔ—ＧＦＰ、蓝色荧光　蛋白、红移型ＧＦＰ（ＲＳＧＦＰ），广泛表达于病毒、细菌、寄生虫、酵　母、昆虫细胞、植物细胞及哺乳动物细胞等。Ｔｅｅｒａｗａｎｉｃｈｐａｎ　等ｎ　通过氨基酸转换获得了增强的ＧＦＰ，并用于观察植物细　胞、动物细胞和细菌。　二、ＧＦＰ的发光原理　在有氧条件下，受紫外光或蓝光激发，ＧＦＰ会自发反应产　生Ｈ　０。，同时肽链发生折叠，其６５～６７位氨基酸残基Ｓｅｔ－　Ｔｙｒ－Ｇｌｙ自身折叠环化，形成三肽环形发色团，发出绿色荧光，　光亮的强度取决于量子产量、摩尔消光系数和折叠性能。其最　亡。因此，进一步研究ＧＦＰ对细胞的细微影响很有必要。　四、ＧＦＰ的应用　基金项目：益普生腹泻基金资助项目，编号：ＩＤＦ一２００７—０４　将ＧＦＰ与特定抗体或细胞因子结合进行融合表达，可广　泛用于科研及临床研究。　（一）在转基因动物研究中的应用　ＧＦＰ在应用于制作转　作者单位　７１００３８西安第四军医大学唐都医院感染病科　通讯作者：聂青和，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｉｅｑｉｎｇｈｅ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ　维普资讯 http://www.cqvip.com 实用肝脏病杂志２００７年１２月第１０卷箜　期—Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｈｅｐａｔｏｌ，Ｄｅｃｅｍ—ｂｅｒ　２００７．Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．６　基因动物的过程中，无需破碎组织或外加底物，通过荧光显微　镜就能显示目的基因在动物体中的表达状况。Ｏｈｔｓｕｋａ等　建　立了转基因小鼠模型，带有源于Ｈｅｓ基因的启动子启动转基因　小鼠体内ＥＧＦＰ的表达。在这些转基因小鼠发育中的大脑里，　只有那些未分化细胞才表达ＧＦＰ，经不对称分裂产生一个ＧＦＰ　异抗原不再存在。当这些杂交细胞形成Ｅｂｓ时，编码三个胚层　的基因以及编码胚外组织的基因均上调，表明这些杂交细胞　有多分化潜能。结果说明，ｈＥＳＣｓ能够重新编码已分化细胞的　核。这些ｈＥＳＣｓ杂交细胞为研究细胞核的重新编码提供了一　个新的模型。　阳性始祖细胞和一个子细胞。他们的实验表明，ｐｌｉｅｓ—ＥＧＦＰ　转基因鼠能够探测大脑形成过程中神经干细胞的相似性以及　不同性。　（八）其他如跟踪观察病原菌，由于病原菌表达ＧＦＰ，可　用荧光法定量地检测病原菌的增殖情况，直接显示病原菌在细　胞或组织中的分布和药物作用情况。Ｓｏｎｇ　ＤＳ等　应用绿色　荧光蛋白标记技术示踪Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＧ１，皮下注射ＭＴＸ制作大鼠　化疗模型后，从大鼠的肠系膜淋巴结、肝、脾和肾均可分离出　（二）在基因治疗中的应用　Ｇａｌｉｐｅａｕ等　一发现构建包含　ＨＳＶ—ＴＫ和ＧＦＰ基因的多顺反子反转录病毒载体，利用ＧＦＰ　的荧光特性，定量检测分析该载体的转染和表达效率。研究结　果表明，该载体能特异转染肿瘤细胞，其转染效率优于其他常　用病毒载体。ＧＦＰ还可用于研究胶质瘤基因治疗中各种表达　载体的转染效率。　（三）筛选新的药物　由于ＧＦＰ不干扰细胞的生长和功　能，因此可同时使用不同颜色的ＧＦＰ衍生物标记相关的蛋白　质，观察单细胞内相互作用的靶蛋白，再借助于荧光激活细胞　分离器等焦显微镜分离出目的细胞，可方便地用于大规模筛选　新的药物。　（四）在临床检验中的应用　可采用基因工程的方法生产　ＧＦＰ标记的抗原或抗体，取代传统的免疫学标记方法，建立简　便、快速的免疫诊断新技术。如利用基因工程技术表达的　ＧＦＰ—ＨＢＶ　ｅ抗原融合蛋白，兼有荧光和抗原活性，从而实现了　用ＧＦＰ等分子标记肝炎病毒。　（五）ＧＦＰ生物合成　利用ＧＦＰ生物合成有色纤维将靶插　入水母ＧＦＰ基因的丝蛋白昆虫病毒，感染蚕的幼虫，用改造的　基因取代蚕的正常基因，当蚕吐丝时，这种丝可成为一种能在　黑暗中发绿色荧光的纤维ｌ】　。　（六）进行单细胞研究Ｈａａｓ等＿　】通过一个充满ＤＮＡ或　其他大分子的微小吸液管进行电刺激，将吸液管顶端的一个单　细胞打孔后将基因导人，用这种电穿孔法将编码增强型ＧＦＰ　的质粒转至完整的大鼠海马脑片后，ＧＦＰ便可在单个神经元或　胶质细胞中表达，通过在体成像显示细胞的形态、突触动力学　和生长速度特征等。　（七）在干细胞中的应用　Ｋｏｕｓｋｏｆｆ等ｌ】　把ＧＦＰ插入到　Ｂｒｙ位点上。Ｂｒｙ是一种转录因子Ｔ—ｂｏｘ家族的成员，在新生　的中胚层中表达，随着中胚层细胞的分化其表达水平下降。用　这个模型，Ｋｏｕｓｋｏｆｆ等用ＧＦＰ标记了胚胎体形成早期过程中　的两个中胚层细胞系，他们表达酪氨酸激酶受体Ｆ１Ｋ１的水平　不同。表达Ｆ１Ｋ１细胞包含了大多数的胚细胞克隆形成细胞　ＢＩ　２ＣＦＣｓ，不表达Ｆ１Ｋ１的ＧＦＰ细胞几乎没有ＢＬ—ＣＦＣｓ，但体　外培养２０ｄ后也能形成这些细胞。这两个细胞系的分化潜能　说明它们代表了成血管前细胞（ＧＦＰ一）向成血管细胞（ＧＦＰ—　Ｆ１Ｋ１一）发展的一个过程。Ｊｕｎ等　。］从人胚胎生殖嵴干细胞多　能性调节因子Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰ基因敲人人胚胎干细胞（ｈＥＳＣｓ）系　诱导产生骨髓前体细胞，在这些细胞中检测到Ｏｃｔ４－ＥＧＦＰ的　表达被抑制，然而与未分化的ｈＥＳＣｓ在体外融合后，处于Ｏｃｔ４　启动子／调节基因区ＥＧＦＰ重新得到表达，而骨髓前体细胞特　ＧＦＰ标记的Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＧ１，证明了ＭＴＸ能引起细菌移位。Ｐａｒｋ　等　通过构建ＸｃｍＩ—ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　Ｔ载体可直接扩增ＰＣＲ产物。　Ａｓｈｂｙｌ等Ｅｌ　６］用ＰＨ敏感的ＧＦＰ示踪细胞表面蛋白，效果明　显。　目前，我们采用绿色荧光蛋白标记技术建立示踪菌，研究　大鼠在急性、慢性肝衰竭时的细菌移位情况，进一步探讨肠道　菌群失调导致的内毒素血症和细菌ＤＮＡ移位分子机制。综上　所述，ＧＦＰ标记技术简单易用、直观稳定、结果可靠，具有很高　的灵敏度和分辨率，能使我们在尽量不干扰活细胞功能的情况　下，直接观察蛋白分子的变化。故有理由相信，随着研究的不　断深入，ＧＦＰ必将发挥巨大的潜力，更广泛的应用于基础研究　和临床医学领域。　参考文献　［１］　ＰＲＡＳＨＥＲ　ＤＣ，ＥＣＫＥＮＲ０ＤＥ　ＶＫ，ＷＡＲＤ　ＷＷ，ｅｔ　ａ１．　Ｐｒｉｍａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ　ｇｒｅｅｎ—。ｆｌｕｏｒｅｓ—。　ｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９２，１１　１：２２９—２３３．　［２３　ＣＨＡＬＩＦＥ　Ｍ．ＴＵ　Ｙ，ＥＵＳＫＩＲＣＨＥＮ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ＿Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ａ　ｍａｋｅｒ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４。２６３：８０２—８０５．　［３］　、）Ｉ　ＤＤ　ＷＷ．Ｐｈａｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　［Ｍ］．Ｓｍｉｔｈ　Ｋｃ，ｅｄ．Ｐｌｅｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，１９７９：卜５７．　Ｅ４７　ＴＥＥＲＡＷＡＮＩＣＨＰＡＮ　Ｐ．ＨＯＦＦＭＡＮ　Ｔ，ＡＳＨＥ　Ｐ．ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｊｅｌ—　ｌｙｆｉｓｈ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ（ＧＦＰ）ｔｈａｔ　ａｆｆｏｒｄ　ｂｒｉｇｈｔｅｒ　ｆｌｕｏ—　ｒｅｓｃｅｎｃｅ，ａｎｄ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｖｅｒｓｉｏｎ（ＶｉｓＧｔｅｅｎ）ｉｎ　ｐｌａｎｔ，ｂａｃ—　［５］　ＷＡＲＤ　Ｗ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏ—　ｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ口］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ａｎａｌ，２００６，４７：３９—６５．　［６］　ＷＥＩＮＧＡＲＴ　ＣＬ，ＢＲ０ＩＴＭＡＮ—ＭＡＤＵＲ０　Ｇ，ＤＥＡＮ　Ｇ，　ｅｔ　ａ１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｌａｂｅｌｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｏｒｄｅ—　ｔｅｌｌａ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｏｐｈｉｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，　１９９９，６７：４２６４—４２６７．　［７］　ＬＩＵ　ＨＳ，ＪＡＮ　ＭＳ，ＣＨＯＵ　ＣＫ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓ—　ｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｏｘｉｃ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌｉｖｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］？Ｂｉｏｃｈｅｎ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９，２６０：７１２－７１７．（下转４３３页Ｊ　维普资讯 http://www.cqvip.com 实用肝脏病杂志２００７年１２月第１Ｏ卷第６期Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｈｅｐａｔｏｌ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２００７．Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．６　・　４３３　・　［１０１　ＢＨＵＮＣＨＥＴ　Ｅ．ＦＵＪＩＥＤＡ　Ｋ．Ｃａｐｉｌｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖｅｎｕｌａｒ—　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｌａｂ　Ｃｌｉｎ　Ｍｅｄ，２００６，１４７（５）：　ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｉｎｕｓｏｉｄｓ　ｉｎ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒａｔ　ｌｉｖｅｒ　２３４—２４１．　ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｔｏ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｌｉｖｅｒ　ｂｌｏｏｄ　ｆｌｏｗ［Ｊ１．Ｈｅｐ—　［１　５］　ＹＡＭＡＳＡＫＩ　Ｍ，ＩＫＥＤＡ　Ｋ，ＮＡＫＡＴＡＮＩ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．　ａｔｏｌｏｇｙ，１９９３，１８（６）：１４５０—１４５８．　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｒａｔ　ｓｉｎｕ—　［１１］　０Ｎ０ＲＩ　Ｐ，ＭＯＲＩＮＩ　Ｓ，ＦＲＡＮＣＨＩＴＴ０　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｈｅ—　ｓｏｉｄａ１　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ１　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａｒｔｅｒｉａｌｉｚｅｄ　１ｉｖｅｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｏｒｔａｌ　ｐａｔｉｃ　ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：ａ　ｂｒａｎｃｈ　ｌｉｇａｔｉｏｎ［Ｊ１．Ａｒｃｈ　Ｈｉｓｔｏｌ　Ｃｙｔｏｌ，１９９９，６２（５）：　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎ　ＣＣ１　４一ｔｒｅａｔｅｄ　４Ｏ１—４１　１．　ｒａｔｓ［Ｊ１．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏｌ，２０００，３３（４）：５５５—５６３．　［１　６］　ＡＫＹ０Ｌ　Ｇ．ＥＲＤＥＭ　０，ＹＩＬＭＡＩ　Ｇ．Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｅ　ｆａｔ—　［１２１　ＸＵ　ＧＦ，ＷＡＮＧ　ＸＹ，ＧＥ　ＧＬ，ｅｔ　ａ１．Ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｔｙ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｏｆ　ｃａｐｉｌｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｅｒｉ～ｓｉｎｕｓｏｉｄ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎ　ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｓａｕｄｉ　Ｍｅｄ　Ｊ，２００５，２６（１２）：１９０４—１９１Ｏ．　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ１．ｗｏｒ１ｄ　Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００４，１　０（２）：　［１７］　ＮＥＵＢＡＵＥＲ　Ｋ，ＳＡＩＬＥ　Ｂ。ＲＡＭＡＤ０ＲＩ　Ｇ．Ｌｉｖｅｒ　ｆｉ—　２３８～２４３．　ｂｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ａｌｔｅｒｅｄ　ｍａｔｒｉｘ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｃａｎ　Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎ—　［１３］　ＺＨＡＮＧ　ＲＰ。ＺＨＡＮＧ　ＷＨ，ＸＵＥ　ＤＢ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｒｐｈｏｌ—　ｔｅｒｏ１．２００１，１５（３）：１８７—１９３．　ｏｇｙ　ｏｆ　ｐｏｒｔａｌ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　［１８１　ＴＡＫＡＴ０　Ｕ，ＫＹＵＩＣＨＩ　Ｔ．Ｐｏｒｔａ１　ｈｙｐｅｒｔｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｒｏ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＣＣ１　４：ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌ（ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌ１）［Ｊ１．ＫＡＮ　ＴＡＮ　ｓｕＩ（Ｊａｐａｎ）　ｄｏｇｓ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｈｕａ　Ｙｉ　Ｘｕｅ　Ｚａ　Ｚｈｉ，２００４，８４（１３）：　２０００，４０：２７５－２８１．　１１１８—１１２１．　（收稿：２００７—０１—２２）　［１４］　ＢＲＩＤＬＥ　ＫＲ，Ｉ　Ｉ　Ｌ，０ＮＥＩＬＬ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ　ａｃｔｉ—　（校对：郭顺明）　ｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｂｙ　ｉｎｓｕｌｉｎ—ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－１　ａｎｄ　ｐｌａｔｅｌｅｔ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｒａｔ　丫—丫—’ｒ—丫—丫—丫—丫—丫—丫—丫—’ｒ　丫—丫—丫—’ｒ　丫—Ｙ—‘ｒ—Ｔ—’ｒ　—丫—丫—丫—丫—丫　（上接４２１页）　［１　３］　ＪＵＮ　ＹＵ，ＶＯＤＹＡＫＩＫ　ＭＡ，ＰＩＮＧ　ＨＥ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　［８１　ＯＨＴＳＵＫＡ　Ｔ，ＳＨＩＭＪＯ　Ｈ．Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ　ｆｏｌ—　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｈｅｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｌｏｗｉｎｇ　ｃｅｌｌ—ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ［Ｊ１．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２００６，２４：１　６８—　［Ｊ１．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００６，３１：１０９—１２２．　１　７６．　［９］　ＧＡＬＩＰＥＡＵ　Ｊ，ＬＩ　Ｈ，ＰＡＱＵＩＮ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａ—　［１４１　ＳＯＮＧ　ＤＳ，ＳＨＩ　Ｂ，ＸＵＥ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏ—　ｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ　Ｇ　ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ　ｒｅｔｒｏｖｅｃｔｏｒ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｔｅｉｎ　１ａｂｅｌｉｎｇ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＧ１　ｃｏｎｆｉｒｍｓ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａ１　ｖｉｖｏ　ｓｕｉｃｉｄｅ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂｒａｉｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｂａｃｔｅｒｉａ１　Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　Ｒａｔ　ｍｏｄｅ１　ｏｆ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　［Ｊ１．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９９，５９：２３８４—２３９４．　［Ｊ１．Ｃｕｒｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００６，５２：６９—７３．　［１０１　ＹＡＭＡ０　Ｍ，ＫＡＴＡＹＡＭＡ　Ｎ，ＮＡＫＡＺＡＷＡ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．　［１５］　ＰＡＲＫ　ＨＫ，ＺＥＮＧ　ＣＹ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ＸｃｍＩ—ｇｅｎｅｒ—　Ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｉｌｋｗｏｒｍ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ａｔｅｄ　Ｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｂｅａｒｉｎｇ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ　［Ｊ１．Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，１９９９，１３：５１１—５１６．　ｆｏｒ　ｄｉｒｅｃｔ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ１．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　［１１１　ＨＡＳＳ　Ｋ，ＳＩＮ　ＷＣ，ＪＡＶＡＨＥＲＩＡＮ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｓｉｎｇｌｅ—ｃｅｌｌ　２００７，３６０：１４４～１４５．　ｅ１ｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　ｖｉｖｏ［Ｊ］．　Ｎｅｕｒｏｎ，　［１６］　ＡＳＨＢＹ　ＭＣ，ＬＢＡＲＡＫＩ　Ｋ，ＨＥＮＬＥＹ　ＪＭ．Ｉｔ　ｓ　ｇｒｅｅｎ　２００１，２９：５８３—５９１．　ｏｕｔｓｉｄｅ：Ｔｒａｃｋｉｎｇ　ｃｅｌ１　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　Ｐｈ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　［１２］ＫＯＵＳＫＯＦＦ　Ｖ，ＬＡＣＡＵＤ　Ｇ，ＳＣＨＷＡＮＴＺ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ　ＧＦＰ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４，２７　７２５７—２６１．　Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ｍｅｓ　（收稿：２００７—１１—５）　ｏｄｅｒｍ　ｄｕｒｉｎｇ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ［Ｊ］　（校对：郭顺明）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ１　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００５，１０２：１３１　７Ｏ一１３１　７５．