一．实习目的
为了使学生能够理论联系实际，通过亲自实地解剖感染小鼠，对小鼠的心、肝、脾进行麦康凯琼脂平板划线培养，以柯赫法则为这次实习的主线，达到鉴定出小鼠感染的菌种的目的，熟练运用微生物实验课的所涉及的实验操作和方法，提高实验动手能力，分析实验过程中可能出现的问题，并解决问题。特开设微生物教学实习，掌握基本技能，加深理论部分的理解，能够独立诊断出传染病病菌，获得严谨的科学实验素养。
二．实习材料
实验动物：一只被感染小鼠，一只健康小鼠
实验器械，主要包括：小鼠解剖工具手术剪、镊子、蜡盘、钉子，接种棒、酒精灯、打火机、记号笔、手套、载玻片、枪头、注射器、离心管。
实验材料：麦康凯琼脂平板、各种染色液（结晶紫溶液、碘溶液、酒精、沙黄水）、蒸馏水、培养基（普通肉汤培养基、蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、固体培养基）、PBS重悬液、生化试验材料（微量发酵管（葡、乳、枸、尿素、麦、甘醇、蔗、硫）、对二甲基氨基苯甲醛、乙醚、甲基红、vp甲乙液）。
实验主要仪器：离心机，分光光度器，温箱，摇床，超净工作台
三．实习内容
以柯赫法则为主线，通过对感染小鼠的剖解采样、分离培养、镜检、扩增培养，然后把得到的纯培养物对健康小鼠进行再次接种以获得被感染小鼠，再次重复以上操作，把获得的纯培养物通过镜检观察和做生化实验来鉴定出感染小鼠的致病菌。
四．实习操作进程
第一天：实验设计、讨论症状、分离剖解
1 实验设计：以小组为单位进行实验设计，明确此次实验主要法则是：柯赫法则。在老师的指导下确定此次实习的主要步骤，讨论实验中可能遇到的问题以及注意事项。
2 讨论症状：比较观察健康小鼠与病鼠，可见到病鼠一般呈萎靡状，不活跃。每组领取一只感染小鼠观察症状，体表基本正常。
3 分离剖解：先将麦康凯琼脂平板分三区，依次写上肝、脾、心。右手抓起小鼠尾巴，将小鼠摇晕，采用颈椎脱臼法将小鼠处死。将小鼠尸体仰卧固定于蜡盘上，充分露出胸腹部。先用小鼠腹部柔软部用剪刀剪一小口，然后从该小口处往上、往下剪将皮毛剥离，剥离腹膜暴露出肝脏和脾，可观察到有轻微的肝肿胀，颜色变淡。将肝和脾切开一小口，用接种环取样，在麦康凯琼脂平板的相应区域进行划线分离。再打开胸腔观察，可见胸腔有出血现象和凝血块，剪开心包膜，将心脏切一小口，用接种环取样，在麦康凯琼脂平板的相应区域进行划线分离。写上班级组别，日期，置于温箱中培养至第二天早上8点。
第二天：挑取单菌落，镜检，扩增培养，重悬，测OD配浓度，小鼠腹腔注射
1 挑取单菌落：观察麦康凯琼脂平板上菌落的形态为圆形，边缘整齐，表面光滑，暗红色，圆心处颜色较边缘浅。挑去单个菌落，画上记号准备做后续试验。
2 镜检：选取所挑选菌落的一半进行抹片。取干净玻片，滴半滴去离子水，用接种环挑取菌进行抹片、干燥固定、采用格兰染色法染色：草酸铵结晶紫染色1-2’，水洗，革兰氏碘液媒染1-2’，水洗，95%酒精脱色约30’’-1’，水洗，沙黄水溶液复染10 ’ ’-30 ’ ’，水洗。吸干，镜检。观察到该菌被染成红色，是格兰阴性菌。
3 扩增培养：选取剩余的菌接种到肉汤培养基中，置于温箱培养9个小时至菌的生长对数期。
4 重悬测OD值配浓度：下午5点左右，将培养的菌转入无菌小管中离心，离心后可见菌沉于管底，在超净工作台内操作，去上清液，用枪头吸取PBS液至去了上清液的`菌管中，反复吹打使其重悬，然后再次离心，去上清，重悬，通过分光光度计测得OD590的值，配成2x10^7CFU浓度的菌液。
5 小鼠腹腔注射：每组挑选一只健康小鼠，在头部或尾部做上记号，用右手抓住鼠尾，将其摇晕，令其前爪抓住铁丝盖上，然后用左手的拇指和食指捏住小鼠头颈部皮肤，并翻转左后使其腹部朝上，将其尾巴夹在左手掌与小指之间，右手把持注射器吸取2mL菌液，在股后侧面插入针头，先刺入皮下，后进入腹腔，注射时阻力，皮肤也无泡隆起。注射完将小鼠放回鼠笼即可。
第三天：观察小鼠发病情况
小组成员分时间段观察小鼠感染情况，见小鼠濒死的尽快解剖接种分离致病菌。若 一整天未见小鼠有异常情况的等第二天解剖
第四天：剖解划线培养
虽然小鼠未见萎靡，由于预订的感染时间差不多，可以进行解剖接种第一天的操作，
可见体表有淤血点，剖开的小鼠肝脏流出大量的血液。其余均同第一天的操作，将麦康凯琼脂平板的上所接的菌置于温箱中培养。
第五天：生化鉴定
观察到平板上只有一个较小的暗红色菌落，挑取该菌落进行扩增培养9小时至细菌生长的对数期。下午6点观察，培养液依旧是澄清的，很可能没有长菌。为做进一步的验证，进行生化试验。将该菌接入微量发酵管和蛋白胨以及葡萄糖蛋白胨中，培养至第二天看结果。
第六天：观察结果，整理报告
生化试验无任何反应，说明接的菌为杂菌或污物，整理实验报告并分析失败原因。
六．实验结果与分析
此次试验失败
给小鼠攻毒，未能分离出致病菌，因此也无法鉴定出小鼠被感染的病原菌为何种肠杆菌科
试验失败原因可能有：
1、接种棒火焰消毒后，等待冷却的时间过短，接种棒接种菌时将菌烫死
2、由于小鼠的免疫力强，使得感染小鼠的病原菌被免疫掉了，因此未接种到治病菌
3.给小鼠注射的量或浓度还不够未能达到使小鼠感染的目的
4、在第一次从小鼠体内分离出来的菌可能不是致病菌，或者麦康凯琼脂平板上培养出来的 菌落不止一种，而我们挑选到的某一菌落恰好不是致病菌。
5、在进行腹腔注射时，可能没有注射到腹腔，而只注射到皮下，或者其它部位。
6、采样时可能由于接种环未完全伸入到心、肝、脾的组织中，或者伸到的组织里 恰好没有致病菌
7、可能由于小鼠感染的时间过短，还未达到菌生长曲线的高峰期
七．思考与总结
1、此次试验失败的原因有很多在我看来最有可能的原因有以下几点：
（1） 小鼠免疫:由于这些小鼠是实验室的小鼠，长期被用来做各种致病菌的实验，使得它们获得一定的免疫，所以虽然注射了足够使小鼠感染发病的剂量，但也被小鼠免疫掉了，而无法从小鼠体内获得病料。
（2） 病料不够：从学姐那了解到，她们做攻毒实验的动物，都是将整个组织块磨碎以后，再接到培养基上，而我们做实验是只是用接种棒挑取一点，接种棒上粘到的病料比较少或根本没有，因此培养不出菌。
（3） 挑取的单菌落未必是致病菌：由于平板上长出可能不止一种菌，因此挑到的单菌落，未必是致病菌。
2、为什么扩增出来的菌不直接注射小鼠，而要经过离心？
因为菌可能会产生毒素，若直接注射可能就无法判断使小鼠发病的到底是毒素作用，还是因为病菌在小鼠体内繁殖感染而造成的。
3、肠杆菌科有哪些，特征有哪些？
学生自我鉴定：
xx年5月16号到21号期间进行了维持一周的微生物实习，在微生物实习期间，我能够做到主动和小组成员交流、合作、解决问题，认真完成实验操作，学会灵活运用自己的专业知识解决问题。
通过这段时期的实习，我们对无菌操作有了进一步的理解，掌握了仪器操作的基本技能，巩固了理论部分的知识，也了解到公共卫生意识的重要性。
实习不过短短的五天，在这短暂的五天内，我们有过发现时的喜悦，有过解剖小鼠时的紧张，有过培养不出菌时的困惑，但最终我们收获了知识，也收获了友谊，在合作中共同进步，在困难中共同进退，一切的困难便能迎刃而解。
这次微生物实习为我们专业的继续拓展提供了宝贵的经验，为动物医学本科专业的我们学习后续课程奠定扎实的基础。
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