MM_FS_CNG_0352食物 烟酸 酸度 浑浊度法
MM_FS_CNG_0352
食物中烟酸的测定方法
1.适用范围
本方法适用于各类食物中烟酸的测定。
2.原理概要
某一种微生物的生长，必需某些维生素，例如L. arabinosus17 - 5之生长需要烟酸，培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下，该细菌生长的情况，以及它的代谢物乳酸的浓度是与培养基中该维生素含量成正比的，因此可以用酸度或浑浊度的测定法来测定样品中烟酸的含量。本方法检出限为10ng。
3.主要试剂和仪器
3.1.主要试剂
甲苯；
盐酸：3mol／L溶液；
盐酸：1∶5（V／V）溶液；
硫酸：0.5mol／L溶液。于2000mL的烧杯中先注入700mL水，将28mL硫酸沿烧杯壁慢慢倒入水中，用水稀释至1000mL；
冰乙酸：0.02mol／L溶液；
氢氧化钠：40％溶液。溶200g氢氧化钠于水中，稀释至500mL；
氢氧化钠：0.1mol／L溶液。溶4g氢氧化钠于水中，稀释至1000mL；
乙醇：25％（V／V）溶液；
酪蛋白：不含维生素；
不含维生素酪蛋白的制备
乙醇处理法：称取100g酪蛋白细粉于烧瓶中，加入300mL 95％乙醇，在水浴中加热回流1h，减压抽滤，弃去滤液，再加入乙醇回流，如此反复3～4次，至滤液呈微黄色或无色，取出在烘箱内70～80℃干燥即可；
酸洗法：称取250g酪蛋白，置于5L容器中，慢慢加入3.6L水以防止成块，加入浓盐酸2.77mL，搅拌浸泡3min。用虹吸管除去上层清液。加入3.6L水，再加入浓盐酸2.77mL，如此反复8次后，再加水3.6L，加入55.5mL 12mol／L氨水，放置过夜，使酪蛋白溶解成浆状。用布过滤，于滤液中慢慢加入约50mL3mol／L盐酸，调至pH4.5，使酪蛋白全部沉淀，过滤。弃去滤液，用50～60℃热水冲洗数次，挤压去水，放入烤箱内于100℃烤干即可；
酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500mL烧杯中，加200mL 3mol／L盐酸，于压力蒸汽消毒器内10.3×104 Pa（151b／in2）压力下水解6h。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200mL水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以除去盐酸。注意每次蒸发时不可蒸干或使之焦糊，因为蒸到这样程度，水解液所含营养物已被破坏。用40％氢氧化钠调节pH至3.5，以溴酚蓝作外指示剂。加20g活性炭，振摇，过滤。如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500mL，加少许甲苯于冰箱中保存；
胱氨酸、色氨酸溶液：称取4gL -胱氨酸和1g L -色氨酸（或2gDL-色氨酸）于800mL水中，加热至70～80℃，逐滴加入1∶5（V／V）盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温，加水稀释至1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存。
腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98％）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250mL烧杯中，加75mL水和2mL浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100mL。加少许甲苯于冰箱中保存；
D - 泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液：称取D - 泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg于烧杯中，以水溶解并稀释至1000mL，将此液置于棕色试剂瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存；
核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液：溶解1mg生物素结晶于100mL 0.02mol／L乙酸中，取此液4mL（相当于40μg生物素）于2000mL烧杯中，加入20mg核黄素和10mg盐酸硫胺素，以0.02mol／L乙酸溶解并稀释至1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存，此试剂需保存于棕色瓶中，以防止核黄素被光破坏；
甲盐溶液：称取25g磷酸氢二钾（K2HPO4）和25g磷酸二氢钾（KH2PO4），加水溶解后稀释至500mL，加少许甲苯以保存之；
乙盐溶液：称取10g硫酸镁（MgSO4·7H2O）、0.5g氯化钠、0.5g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和0.5g硫酸锰（MnSO4·H2O），加水溶解后稀释至500mL，加5滴盐酸，加少许甲苯以保存之；
烟酸标准储备液（0.1mg／mL）：准确称取50.0mg已干燥恒重并贮于五氧化二磷干燥器中的烟酸标准品，以25％乙醇溶液溶解并定容至500mL，混匀，于冰箱中保存。此溶液每毫升相当于100μg烟酸；
烟酸标准中间液（1μg／mL）：吸取1.00mL烟酸标准储备液，置于100mL容量瓶中，用25％乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。此溶液每毫升相当于1μg烟酸；
烟酸标准使用液（0.1μg／mL）：临用时吸取5.00mL烟酸标准中间液，置于50mL容量瓶中，用水定容，混匀。此溶液每毫升相当于0.1μg烟酸；
基本培养基储备液：将下列试剂混合于500mL烧杯中，加水至450mL，用40％氢氧化钠溶液调节pH至6.8，以溴麝香草酚蓝作外指示剂，用水稀释至500mL；
酸解酪蛋白 | 50mL |
胱氨酸、色氨酸溶液 | 50mL |
腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 | 10mL |
D -泛酸钙、对氨基苯甲酸、吡哆醇溶液 | 10mL |
核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液 | 10mL |
甲盐溶液 | 10mL |
乙盐溶液 | 10mL |
无水葡萄糖 | 10g |
无水乙酸钠 | 10g |
（或结晶乙酸钠NaAc·3H2O） | （16.6g） |
琼脂培养基：将下列试剂混合于250mL三角瓶中，加水至100mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用1mol／L盐酸趁热调节pH至6.8，尽快倒入试管中，每管3～5mL，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内6.9×104Pa（101b／in2）压力下灭菌15min。取出后竖直试管，待冷至室温于冰箱中保存；
无水葡萄糖 | 1.0g |
乙酸钠（NaAc·3H2O） | 1.7g |
蛋白胨（生化试剂） | 0.8g |
酵母提取物干粉（生化试剂） | 0.2g |
甲盐溶液 | 0.2mL |
乙盐溶液 | 0.2mL |
琼脂（细菌培养） | 1.2g |
生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000mL水中。每次使用时分别倒入6～8支10mL试管中，每支约加10mL，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内6.9×104Pa（101b／in2）压力下消毒15min，备用；
溴酚蓝：0.1％乙醇溶液。称取0.1g溴酚蓝，用乙醇溶解后，再加乙醇稀释至100mL；
溴麝香草酚蓝：0.04％溶液。称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵内，加1.6mL 0.1mol／L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL；
溴麝香草酚蓝：0.001％溶液。量取25mL 0.04％溴麝香草酚蓝溶液，加水稀释至1000mL，供滴定用；
溴甲酚绿：0.04％溶液。称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL 0.1mol／L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。
3.2.仪器
实验室常用设备；
电热恒温培养箱；
压力蒸汽消毒器；
液体快速混合器；
离心机；
硬质玻璃试管：20mm×150mm。
4.菌种与培养液的制备与保存
4.1.储备菌种的制备：以阿拉伯乳酸杆菌（LactobaciLLus arabinosus 17-5 ATCCno.8014，简称Lact.A.）纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在37±0.5℃恒温箱中保温16～24h，取出于冰箱中保存，不超过两周。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作制备接种液之用，必需在使用前每天移种一次，连续2～3d，方可使用，否则生长不好。
4.2.种子培养液的制备：加5mL 0.1μg／mL烟酸标准使用液和5mL基本培养基储备液于一15mL离心管中，塞好棉塞，于6.9×104Pa（101b／in2）压力下灭菌15min，取出，于冰箱中保存。每次制备2～4管，备用。
5.过程简述
5.1.接种液的制备
使用前一天，将Lact.A.菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中。在37±0.5℃恒温箱中保温16～24h，取出离心10min（3000rpm），倾去上部液体，用已灭菌的生理盐水淋洗2次，再加10mL灭菌生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成混悬体，将此液倒入已灭菌的注射器内，立即使用。
5.2.样品制备
称取含烟酸约5～50μg的均匀样品，置于100mL三角瓶中，加50mL0.5mol／L硫酸，混匀，于10.3×104Pa（151b／in2）压力下水解30min，取出冷至室温，用40％氢氧化钠溶液调节pH至4.5，以溴甲酚绿为外指示剂。将水解液转移至100mL容量瓶中，定容，过滤。脂肪含量高的样品，用无水乙醚提取以除去脂肪。此样品水解液可在4℃冰箱中保存数周。取适量水解液于25mL具塞刻度试管中，用0.1mol／L氢氧化钠调节pH至6.8，以溴麝香草酚蓝作外指示剂，用水稀释至刻度，使溶液中烟酸含量约为50ng／mL，此液为样品试液。
5.3.样品试液管的制备
每支试管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0mL样品试液，需做二组。每管加水稀释至5mL，再加入5mL基本培养基储备液。
5.4.标准管的制备
每支试管中分别加入烟酸标准使用液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，需做三组。每管加水稀释至5mL，再加入5mL基本培养基储备液。
5.5.灭菌
样品管和标准管均用棉塞塞好，于6.9×104Pa（101b／in2）压力下灭菌15min。
5.6.接种和培养
待试管冷至室温后，每管接种一滴种子液，于37±0.5℃恒温箱中培养约72h。
5.7.滴定
将试管中培养液倒入50mL三角瓶中，用5mL 0.001％溴麝香草酚蓝溶液分二次淋洗试管，洗液倒入该三角瓶中，以0.1mol／L氢氧化钠溶液滴定，呈绿色即为终点，其pH约为6.8。
6.结果计算
以烟酸标准系列的不同微克数为横坐标，滴定所需0.1mol／L氢氧化钠的毫升数为纵坐标，作标准曲线。用样品液所需的氢氧化钠毫升数由标准曲线上查出每样品管中烟酸含量，分别计算各管中每毫升样品试液烟酸含量，用误差不超过平均值10％的测定结果求出平均值，按下式计算样品中烟酸的含量。
X＝ | cVF | × | 100 | ||
m | 1000 | ||||
式中：X——样品中烟酸的含量，mg／100g； c——每毫升样品试液中烟酸含量的平均值，μg／mL； V——样品水解液定容总体积，mL； F——样品试液的稀释倍数； m——试样质量，g； 100/1000——折算成每100g样品中烟酸毫克数。 | |||||
7.结果的重复性
同一实验室同时或连续两次测定结果相对偏差绝对值≤10％。
8.来源：
GB 12395—90