纯化的蛋白迅速降解原因?
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发布时间：2022-04-23 02:20
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热心网友
时间：2023-10-11 12:36
有的蛋白质在常温常压下是不能成功纯化的，因此你首先应该了解你的目的蛋白。
我们比较幸运能在常温常压下纯化，就我们的经验来说：1.纯化所用的玻璃器皿一定要彻底清洗，蒸馏水冲洗后140度以上高温烘干（可以参见普通的实验室手册）， 其他可高压灭菌的高压灭菌，或用一次性的。这些是最基本的。2.缓冲液中可以加入b-ME或DTT，不过DTT比前者贵得多。3.EDTA常规都加。4.如果你的样本很少又珍贵并且不怕花钱的话，可以联合使用两种以上的蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)(protease inhibitor)（类似cocktail 的方法）如pepstatin、PMSF、leupeptin等，根据情况吧。5.如楼上所说，没有层析柜，可以用一个透明门的冰箱代替；有的实验室有4度冷库，可以直接在里面操作，很不错。6.样品保存也很关键，上样前收集后都须低温保存，一旦鉴定完了就分装冻起来，或是制成干粉，避免反复冻融。
甘油没有用过，你还是在查查吧。
不过各种类型的介质都有流量流速*，这就不用说了。离子交换柱好像对速度的要求更加严格吧？这一点还请楼上的指教。
除了本身纯化过程需要注意以外,也特别小心前面处理的过程,例如超声破碎时间及强度,如果过强和时间长也可能断裂,我觉得得从提取开始检测到底是什么原因,同时看一下蛋白的稳定性,如果是保存你的降解带没有明显变化,那就不一定是自己降解的,也许是处理或者纯化过程造成的,总之要全面监测,好知道到底是什么原因,才好找到相应的办法.
甘油是有一定的作用,但是如果是纯化加的话,那最好别超过10%,否则太粘根本流不动,而且也许蛋白会沉淀堵柱子,还需要考察不同的盐对降解的影响,我知道有的时候高盐也可以抑制降解,还有注意pH,而且可以加点EDTA看看.因为不少酶需要金属离子活性更高.
